绵羊ANO5基因的生物信息学分析

作为Anoctamin蛋白家族的第五个成员,ANO5基因主要在绵羊肌肉再生、肌母细胞融合和肌细胞膜修复中发挥作用。为探究ANO5基因在绵羊体内的功能,本研究利用生物信息学软件分析了绵羊ANO5基因及其编码产物的结构与功能。结果显示:绵羊ANO5基因含有一个最大长度为3351 bp的开放阅读框,推测其编码1116个氨基酸残基。该基因编码蛋白的分子式为C5897H9014N1546O1668S42,分子质量为129602.32 Da,理论等电点为7.24,估计半衰期为30 h,不稳定指数为49.71,脂肪族氨基酸指数为79.43。绵羊ANO5蛋白位于质膜的可能性最大(56.5%),不含信号肽,具有8段跨膜区,属于不稳定亲水性跨膜蛋白。二级结构以无规卷曲(68.43%)为主,三级结构主要由无规卷曲缠绕折叠形成。

ANO5非移码插入突变型GDD家系临床分析及其诱导多能干细胞的构建

目的:建立和鉴定临床发现的一个由ANO5基因新的致病性突变引起的颌骨骨干发育不良(gnathodiaphyseal dysplasia,GDD)家系中患病者和非患病者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。方法 :纳入以颌骨畸形为主要表现的1个GDD家系5例患者,评估患者临床表现、骨影像学、骨密度、骨量等相关生化指标。收集家系中1例患病者与非患病者外周血样本,将表达Oct4、Sox2和Klf4转录因子的仙台病毒转染患病者和非患病者外周血单核细胞,将其重编程为i PSCs,并通过碱性磷酸酶染色、细胞免疫荧光、qPCR、核型分析等检测其干细胞多能性。结果:GDD主要表现为双侧上下颌骨弥漫性多发肿胀,并伴有全身骨密度下降。通过检测,证明患病者及非患病者外周血来源的i PSCs具有多能性。结论:GDD患者外周血单核细胞在体外可被成功诱导为无外源性基因整合的具有多能分化特性的i PSCs,为GDD的发病机制研究提供了高效直接的细胞模型。

MC3T3-E1Subclone14体外诱导成骨模型的建立及Ano5基因表达的研究

目的建立MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型,探讨Ano5基因表达与成骨细胞形成的关系,了解其对成骨分化的影响。方法 MC3T3-E1 Subclone 14细胞贴壁培养,加入条件培养基,分别培养至0d、3d、7d、14d、21d。倒置显微镜下观察细胞形态,通过碱性磷酸酶活力测定和茜素红染色,鉴定成骨细胞。利用REAL TIME-PCR检测Ocn、Colα1、Opg/Rankl、Osterix和Runx2等成骨相关因子的基因表达水平,同时检测Ano5基因在成骨细胞形成过程中的表达趋势。结果体外诱导MC3T3-E1 Subclone 14倒置光学显微镜下观察细胞形态呈梭形。成骨细胞碱性磷酸酶活力逐渐增高。成骨诱导培养至14d和21d,茜素红染色可见细胞表面出现矿化结节。成骨相关因子基因表达均逐渐增高,至21d达到高峰。Ano5基因从诱导分化的第3d开始表达,随后表达量逐渐增高,至14d达到高峰,21d表达量下降。结论在MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导分化为成骨细胞过程中,Ano5基因表达量逐渐升高,至14d达到高峰,21d开始表达量具有下降趋势。

Ano5基因敲除小鼠成骨增强机制的初步研究

目的初步探讨导致Ano5基因敲除小鼠(Ano5^(-/-))成骨增强的潜在机制。方法选取出生2~3天小鼠颅骨成骨细胞(mCOB)进行原代培养,CCK-8实验观察细胞增殖能力,荧光探针染色检测胞内Zn^(2+)离子浓度。利用Agilent Mouse lncRNA V3芯片检测12周雄鼠胫骨组织差异表达基因,实时定量PCR(qRT-PCR)检测胫骨组织及m COB成骨分化过程中锌离子转运体和作用相关基因的表达水平。结果Ano5^(-/-)小鼠的mCOB增殖能力明显增强;细胞内Zn^(2+)浓度在成骨分化的第21天升高。锌离子调控基因Pde4d在骨组织和m COB成骨分化晚期的表达均下降,介导Zn^(2+)胞内转运的基因Zip-8、Zip-14表达增强,而介导Zn^(2+)胞外转运的基因Znt-5、Znt-7表达均降低。结论Ano5基因敲除后通过调控Zn^(2+)转运体相关基因表达改变成骨细胞内Zn^(2+)浓度,可能造成Pde4d-cAMP-CREB轴功能障碍,导致Ano5^(-/-)小鼠成骨功能增强。

Ano5敲除对小鼠骨髓间充质细胞成骨能力及其相关因子表达的影响

目的检测Ano5基因敲除小鼠骨髓间充质细胞成骨能力改变及成骨相关因子的表达。方法选取12周龄雄性小鼠,处死后抽取骨髓行骨髓间充质细胞原代培养,碱性磷酸酶(ALP)活力测定和茜素红染色观察其成骨能力。提取RNA检测成骨相关因子的基因表达。实验分为Ano5^+/+野生型组、Ano5^+/-杂合组和Ano5^-/-纯合组。结果敲除组Ano5^-/-和Ano5^+/-骨髓间充质细胞与野生型相比,ALP活力明显增强(P<0.01),矿化结节数目和面积增加,在成骨诱导分化过程中,成骨相关因子Ocn,Col1α1,Osterix,Runx2,Opg/Rankl表达明显上调(P<0.01),而Ano6表达明显下调(P<0.01)。结论Ano5基因对骨髓间充质细胞成骨能力有负向调节作用,在骨形成过程中发挥重要作用。

ANO5突变导致颌骨长骨发育不良

目的在两个颌骨长骨发育不良(GDD)家系中进行临床特征和致病基因变异鉴定。方法对先证者及其家系成员进行面部和四肢外观畸形骨骼形态的观察,采集先证者及其父母的周静脉外周血3~4 mL;采用常规酚-氯仿法提取外周血基因组DNA;通过全外显子组测序(WES)对先证者进行候选致病基因变异的筛查,再经PCR-Sanger测序在先证者及其家系成员中针对候选致病变异进行变异验证;通过致病变异的家系共分离、变异位点进化保守性、候选致病变异的群体等位基因频率和生物信息学分析进行候选致病变异的致病性鉴定,最终确定上述家系GDD患者的致病变异。结果在两个GDD先证者中均鉴定到ANO5的杂合错义变异。家系1致病变异为位于ANO5第11外显子的c.1066T>G,家系2致病变异为位于ANO5第15外显子的c.1553G>A。上述两个变异分别导致ANO5编码蛋白第356位氨基酸由半胱氨酸变为甘氨酸(p.Cys356Gly),及第518氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸(p.Gly518Glu)。结论本研究首次在中国人群中发现了c.1066T>G(p.Cys356Gly)致病变异,为患者疾病进展预后和未来产前基因诊断提供了重要依据。

家族性巨大型牙骨质瘤家系致病基因新发突变和临床表型分析

目的:应用全外显子测序技术对家族性巨大型牙骨质瘤(familial gigantiform cementoma,FGC)家系进行测序,筛选致病基因及突变,并探讨基因型与临床表型的关系。方法:纳入以颌骨畸形、下肢长骨骨折为主要表现的1个FGC家系9例患者,评估患者临床表现、骨影像学、骨密度、骨转换相关生化等指标。提取9例患者及家系中14名未患病者外周血基因组DNA,进行全基因组外显子捕获及高通量测序,通过生物信息学分析、确定突变位点,利用Sanger测序法对384名未患FGC且无此疾病家族史的受试者进行验证。结果:FGC主要表型为上、下颌骨4个象限内均存在弥漫性多发病灶,以下颌骨体前部尤为严重,颌骨畸形明显;并伴有全身骨密度下降,常因轻微外力导致多次下肢长骨骨折。全外显子测序发现,所有患者均存在ANO5(c.1538C>T,p.Thr513Ile)杂合突变,该突变影响ANO5蛋白功能与结构。结论:FGC是罕见的常染色体显性遗传疾病,中国FGC患者以颌骨畸形、下肢长骨骨折、骨密度降低为主要表型。ANO5基因突变是目前唯一致病基因,扩展了对FGC表型和致病基因突变型的认识。