外源Ca^(2+)对金线莲组培苗生长发育的影响

以金线莲组培苗为试验材料,研究添加不同浓度(0、1.5、3、6、9 mmol/L)Ca^(2+)对金线莲组培苗的气孔细胞、农艺性状、酶活性的影响。结果表明,在1.5 mmol/L Ca^(2+)环境下培养的金线莲叶片宽大、植株也相对健壮,总体长势较好,生理生化指标体现该浓度下的金线莲各类代谢活动较为旺盛,各种关键酶的活性也比较高,抗逆性能较优,6 mmol/L Ca^(2+)环境下培养的金线莲叶片较小且幼嫩,但植株丛芽多而健壮。因此,1.5 mmol/L Ca^(2+)是相对适宜金线莲组培苗生长发育的钙环境,而6 mmol/L Ca^(2+)是相对适宜金线莲长芽扩繁的钙环境。

水氮耦合对金线莲生长和品质的影响

【目的】探究不同水氮耦合处理对金线莲生长和品质的影响,为确定金线莲栽培的适宜水氮耦合方案提供参考。【方法】以大叶金线莲为试材,采取裂区设计,设置3种施氮量(N1:3.3 g/m^(2);N2:6.6 g/m^(2);N3:9.9 g/m^(2))和4种灌水量(W1:(45±5)%θ_(f);W2:(55±5)%θ_(f);W3:(65±5)%θ_(f);W4:(75±5)%θ_(f);其中θ_(f)为田间持水量)组合处理,以不施肥、不灌溉为对照(CK),栽培5个月后,测定13个处理金线莲的生长指标(保存率、株高、单株叶片数、叶长和叶宽、茎节数、节长、根长、根数、单株鲜质量及干质量、折干率)、生理指标(总叶绿素、可溶性蛋白、可溶性糖含量和过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性)和品质指标(总黄酮含量及总多糖、金线莲苷、总生物碱和总氨基酸质量分数),分析灌水量和施氮量对金线莲生长及活性成分的影响。【结果】(1)与CK相比,除N1W1、N3W1处理外,其余处理均可以提高金线莲单株鲜质量、干质量、折干率、茎节数、节长和株高,其中N2W3处理金线莲的单株鲜质量、茎节数、节长、株高均达最大值,较CK分别提高了35.67%,33.18%,16.14%和35.45%。在30~60 d的较短栽培时期内,金线莲栽培的保存率在各处理之间差异不明显,但随着栽培时间延长,N1、N2条件下的水氮耦合优势逐渐显现。与CK相比,各处理金线莲的单株叶片数、叶长、叶宽、根长和根数无显著差异。(2)与CK相比,除N2W1处理外,其余处理均可以提高金线莲可溶性糖含量、SOD活性和总叶绿素含量;除N1W4和N3W4处理外,其余处理均可以降低金线莲的POD活性。与CK相比,各处理对金线莲可溶性蛋白含量有显著影响,同一施氮水平下,W1条件下的可溶性蛋白含量显著高于其他处理。(3)与CK相比,各处理对金线莲总氨基酸和总多糖质量分数均有显著影响,其中N2W3处理的总氨基酸质量分数最高,为9.18%;N1W3处理的总多糖质量分数最高,为45.08%。在W2、W3条件下,金线莲的总黄酮含量和金线莲苷质量分数随施氮量的增加均呈先增后减趋势,施氮效果均表现为N2>N3>N1,且均以N2W3处理最高,分别为25.04 mg/g和19.36%。(4)熵权系数法分析结果显示,12种肥水组合中,耦合作用效果排名前5的处理为N2W3>N2W2>N3W1>N2W4>N3W2。【结论】适宜的水氮耦合处理有利于金线莲生长及活性成分的积累,金线莲较优的肥水组合是灌水量为田间持水量的60%~70%,施氮量为6.6 g/m^(2)。

基于根际土壤真菌和代谢物的广东梧桐山金线兰垂直分布驱动因子分析

采用高通量测序和非靶向代谢组学技术,对广东梧桐山金线兰〔Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.〕核心分布区根际土壤和非分布区土壤中真菌和代谢物进行研究。结果显示:海拔875 m的金线兰核心分布区根际土壤中注释到15门401科905属真菌,海拔775 m金线兰非分布区土壤中注释到13门385科860属真菌,海拔675 m金线兰非分布区土壤中注释到15门407科890属真菌。金线兰核心分布区根际土壤与非分布区土壤真菌群落的物种丰富度和均匀度无显著差异,但群落结构与物种组成差异显著。除未知菌属外,金线兰核心分布区根际土壤中绿僵菌属(Metarhizium Sorokīn)、隔指孢属(Dactylella Grove)、被孢霉属(Mortierella Coem.)、酵母属(Saccharomyces Meyen ex E.C.Hansen)、树粉孢属(Oidiodendron Robak)、粗糙孔菌属(Trechispora P.Karst.)和Pseudophacidium P.Karst.的相对丰度高于金线兰非分布区土壤。共发生网络分析结果显示:绿僵菌属、青霉属(Penicillium Link)和弯颈霉属(Tolypocladium W.Gams)对维持金线兰核心分布区根际土壤真菌群落的结构和功能可能具有重要作用。金线兰核心分布区根际土壤和非分布区土壤中得到1886种代谢物,正离子模式鉴定到1089种代谢物,其中561种代谢物得到注释;负离子模式鉴定到935种代谢物,其中528种代谢物得到注释。金线兰核心分布区根际土壤中显著上调的差异代谢物主要有N 6,N 6,N 6-三甲基-L-赖氨酸、茯苓酸、14,15-脱氢萜烯酸、3-异丙基苹果酸、4-胆甾烯-3-酮、乙酸香茅酯和正癸酸,这些差异代谢物富集的代谢通路主要与氨基酸和脂质代谢有关,可为金线兰及其菌根真菌提供碳源和氮源。相关性分析结果显示:金线兰核心分布区根际土壤显著差异代谢物含量与主要菌属相对丰度存在密切的正相关作用。综上表明:金线兰根际土壤中非菌根真菌与菌根真菌间存在密切的相互作用,并通过碳源、氮源的营养流动影响金线兰的生长发育,进而驱动其垂直分布。

金线莲和白及组培苗菌根真菌接种效应研究

为了进一步探究金线莲和白及组培苗与接种菌株在菌根共生培养体系中的相互关系,以金线莲和白及无菌组培苗为材料,接种菌株建立组培苗菌根共生培养体系,通过测定各生长阶段组培苗的形态指标和生理指标,来比较组培苗对不同菌株的反应。金线莲A2菌株处理对组培苗地上和地下部分生长均有明显促进作用,其平均鲜重增长率分别比A1、CK_(1)处理高20.9%、19.1%;A2处理的叶片数、株高、根增长率、根数、根长分别比CK_(1)处理高21.7%、2.7 cm、16.9%、48.3%、65.8%。白及B1、B2菌株处理对组培苗地上和地下部分生长均有促进作用,B1、B2处理生长指标都高于对照,B1处理的鲜重增长率、叶片数、株高、根增长率、根数、根长分别比CK_(2)处理高3.9%、41.8%、3.7 cm、25.8%、33.0%、52.6%。综合来看,除了A1菌株在前期有一定的负面影响,其他菌株在整个共生培养期间对组培苗生长均有积极的促进作用。

金线莲应答高温胁迫的转录组学特征分析

为了研究高温胁迫下金线莲转录组表达特征,分析其热激响应机制。以正常培养和高温胁迫(45o C)的金线莲(NYJ2)为材料,利用Illumina HiSeqTM2000平台进行测序,通过Trinity软件进行De novo组装。结果共获得75688个unigene,有28323个unigene在Nr、KOG、KEGG和Swisspro数据库中得到功能注释,注释率为37.42%。其中,17532个unigene在KOG数据库中可归类到25个功能家族;10108个unigene被KEGG数据库注释到128个代谢途径中;17485个unigene被GO数据库的生物过程、分子功能和细胞组成三大功能注释到47个条目中。777个unigene在高温胁迫前后差异表达显著,其中胁迫后上调表达为362个,下调表达为415个,获得响应热胁迫的基因24个,包括热激蛋白的基因1个,PSⅠ和PSⅡ相关的基因15个、叶绿体rbcL基因3个、PLD基因2个,CAT编码基因、GAPDH基因、CYP编码基因各1个。本研究从转录组水平分析了金线莲对热胁迫的响应,这些数据将为功能基因的鉴定奠定基础,为培育耐高温金线莲品系提供了参考依据。

DA-6与椰汁对金线莲组培苗壮苗生根的影响

目的:解决金线莲组培苗纤细、生根系数和整齐度低的问题,优化金线莲组培快繁技术体系,提高种苗质量。方法:应用己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)和天然椰汁,采用析因设计方差分析方法,探究25个组合处理对金线莲不定芽壮苗生根的效果。结果:5~10 mg/L DA-6和10%~15%椰汁对株高有较好的促进作用;5~15 mg/L DA-6和5%~10%椰汁促进金线莲根的生长。且以同时添加DA-6与椰汁的处理组增效效应明显,10 mg/L DA-6与10%~15%椰汁处理(T15、T16)的壮苗生根效果优于其他处理组。结论:结合株高、根系质量、茎粗、叶数和单株鲜重等指标值综合评估,促进金线莲不定芽壮苗生根的最佳培养基为T15(MS+4 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA+10 mg/L DA-6+10%椰汁+2%蔗糖+1%卡拉胶),组培苗的生长质量优于其他24个处理,该研究结果为金线莲组培快繁技术体系的优化及其产业化提供了依据。

金线莲资源遗传多样性分析及耐热性评价

金线莲(Anoectochilus roburghii)是具有极高经济价值的珍稀濒危兰科药用植物,高温是制约其广泛生产栽培的首要限制因子,选育耐热品种是抵御高温热害最经济有效的措施之一。本研究利用目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记技术对24份金线莲种质资源进行遗传多样性分析,并利用多元统计分析的方法对其中20份样本进行耐热性评价。遗传多样性分析结果显示:在遗传系数0.602水平上,可以把金线莲种质分成I和II两大类,I类分成A和B两个亚群,台湾金线莲(TJ)与其他资源遗传距离较远,单独归为II类;A亚群中除了W来源于云南,其他均为福建西北部收集的资源;B亚群主要来自闽南地区和广西。通过对20份金线莲资源5个生理参数测定,发现热处理后叶绿素含量和SOD活性明显下降,相对电导率明显升高,而丙二醛和可溶性蛋白含量热处理后各资源表现不一。利用多元统计分析方法进行耐热性初步评价,结果显示,TL、L1、A20、GZ1等4份资源较为耐热,TJ、HX、L、M、A21等5份资源不耐热。

Combined analysis of transcriptomics and metabolomics revealed complex metabolic genes for diterpenoids biosynthesis in different organs of Anoectochilus roxburghii

Objective:Diterpenoids with a wide variety of biological activities from Anoectochilus roxburghii,a precious medicinal plant,are important active components.However,due to the lack of genetic information on the metabolic process of diterpenoids in A.roxburghii,the genes involved in the molecular regulation mechanism of diterpenoid metabolism are still unclear.This study revealed the complex metabolic genes for diterpenoids biosynthesis in different organs of A.roxburghii by combining analysis of transcriptomics and metabolomics.Methods:The differences in diterpenoid accumulation in roots,stems and leaves of A.roxburghii were analyzed by metabonomic analysis,and its metabolic gene information was obtained by transcriptome sequencing.Then,the molecular mechanism of differential diterpenoid accumulation in different organs of A.roxburghii was analyzed from the perspective of gene expression patterns.Results:A total of 296 terpenoid metabolites were identified in the five terpenoid metabolic pathways in A.roxburghii.There were 38,34,and 18 diterpenoids with different contents between roots and leaves,between leaves and stems,and between roots and stems,respectively.Twenty-nine metabolic enzyme genes with 883 unigenes in the diterpenoid synthesis process were identified,and the DXS and FDPS in the terpenoid backbone biosynthesis stage and CPA,GA20ox,GA3ox,GA2ox,and MAS in the diterpenoid biosynthesis stage were predicted to be the key metabolic enzymes for the accumulation of diterpenoids.In addition,14 key transcription factor coding genes were predicted to be involved in the regulation of the diterpenoid biosynthesis.The expression of genes such as GA2ox,MAS,CPA,GA20ox and GA3ox might be activated by some of the 14 transcription factors.The transcription factor NTF-Y and PRE6 were predicted to be the most important transcription factors.Conclusion:This study determined 29 metabolic enzyme genes and predicted 14 transcription factors involved in the molecular regulation mechanism of diterpenoid metabolism in A.roxburghii,which provided a reference for the further study of the molecular regulation mechanism of the accumulation of diterpenoids in different organs of A.roxburghii.

不同基质对金线莲栽培的影响

以野生金线莲[Anoectochilus roburghii(Wall.)Lindl]为试验材料,研究不同基质对野生金线莲栽培驯化的影响,通过分析金线莲叶长、叶宽、叶间距、株高及叶片数等指标,以期筛选出适宜的基本培养基质。结果表明,4种基质中以椰糠的栽培效果最好,其叶长、叶宽、叶间距、株高均显著优于其他3组,不同栽培基质之间,叶长、叶宽、叶间距和株高差异显著。研究结果可为金线莲迁地保护与栽培提供技术参考和理论依据。

金线莲菌根真菌的分离及其生物活性研究

目的 研究野生金线莲 [Anoectochilusroxburghii (Wall.)Lind]根内菌根真菌的种类及其生物活性。方法 菌根真菌的分离采用平皿点种法 ;生物活性测定采用促进植物种子萌发和对幼苗生长作用方法。结果 从野生金线莲根内分离获得 2 1种菌根真菌 ,其中 6种真菌对天麻 (GastrodiaelataBl.)和长苏石斛 (DendrobiunbrymerianunLindl)种子萌发有促进作用 ;5种真菌对金线莲幼苗生长有显著促进作用。结论 通过对有生物活性真菌的进一步研究 。

金线莲种子诱导成苗的研究

诱导金线莲Anoectochilus roxburghii种子萌发成原球茎的适宜培养基是Knudson C,萌发率约60％;促使原球茎分化成苗的适宜培养基是Knudson C+6-BA0.5 mg/L+马铃薯提取物20％,成苗率可达51％。

HPLC-UV-MS/MS法对金线莲中黄酮类组分的鉴定和测定

利用HPLC-UV-MS/MS方法对金线莲中黄酮类组分进行分析鉴定和含量测定.液相色谱分离采用ZORBAX Eclipse XDB-C18分析柱,以乙腈和水（含0.03％甲酸）为流动相梯度洗脱,流速为0.5 mL/min.根据ESI-MS/MS分析,并与标准品和文献数据比较,确定金线莲中含有10种黄酮类组分.其中五个已知的黄酮类组分在线性范围内,线性良好（R2≥0.9995）,最低检测限（LOD）范围为129.45 ～ 223.56 ng/mL,回收率范围为98～106％（RSD值均小于3.49％）.实验表明,所建方法具有高选择性和高灵敏度,适于组培金线莲的质量控制.

花叶开唇兰种子非共生萌发的研究

目的筛选花叶开唇兰种子非共生萌发最佳培养基。方法比较不同的基本培养基、蔗糖质量浓度、植物生长物质和培养方式对种子萌发的影响，观察并统计种子萌发率。结果花叶开唇兰种子萌发最适培养基为1／4MS＋NAA0．1～0．5mg／L＋蔗糖20g／L，液体悬浮培养。结论首次报道了花叶开唇兰种子萌发最佳培养基，为花叶开唇兰快速繁殖提供技术参考。

HPLC法同时测定金线莲中6种成分

目的建立HPLC法同时测定金线莲Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.中芦丁、异槲皮苷、水仙苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素的含有量。方法金线莲60%乙醇提取物的分析采用Agilent TC-C_(18)色谱柱(4. 6 mm×250 mm,5μm);以乙腈-水(含0. 1%甲酸、5%甲醇)为流动相,梯度洗脱;体积流量1 mL/min;检测波长368 nm;柱温30℃。对结果进行主成分分析。结果 6种成分在各自范围内线性关系良好(r=0. 999 9),平均加样回收率为93. 37%~101. 94%,RSD为1. 72%~3. 18%。组培品6种成分平均含有量显著低于栽培品和野生品; 32批样品分为2大类,2个主成分的贡献率达80. 6%。结论该方法准确稳定,重复性好,可用于金线莲的质量控制。

金线莲多倍体诱导的初步研究

在离体培养条件下,研究了秋水仙素不同浓度、不同处理时间对金线莲的诱变效果.结果表明:0.1%秋水仙素溶液浸泡处理48h诱变效果最佳,其诱变率可达48%.变异植株与对照二倍体植株相比,植株高大,茎段粗壮,节间长,叶大而厚,叶色深,根粗壮.叶片气孔及保卫细胞增大而单位叶面积气孔数减少,保卫细胞中叶绿体数增多.对变异株进行根尖染色体观察发现,其根尖细胞体积明显增大,染色体数目增多.

金线莲人工种子制作技术及萌发研究

以金线莲为实验材料,通过液体悬浮培养建立原球茎悬浮系,并以原球茎为人工种子的繁殖体,研究了人工种皮基质、人工胚乳组分、贮藏条件、萌发基质等对人工种子萌发率和成苗率的影响。结果表明,以4%海藻酸钠+2%CaCl2+2%壳聚糖为人工种皮基质,1/2MS液体培养基+0.2mg/LNAA+0.1mg/LGA3+0.5mg/LBA+0.4mg/L青霉素+0.3%多菌灵粉剂+0.2%苯甲酸钠+1.0%蔗糖+1.0%活性炭作为人工胚乳成分制作的人工种子,其萌发率和成苗率最高。这样的人工种子在4℃条件下贮藏20天后的萌发率及成苗率分别为58.3%和55.5%,随着贮藏温度的升高和贮藏时间的延长,人工种子的萌发率和成苗率均大幅度下降。

金线兰提取液清除NO_2^-作用的实验研究

按国家标准GB\T5009.33—1996中“格里斯试剂比色法”测定了金线兰全草水提液、各营养器官水提液和金线兰全草石油醚提取部位(AP)、氯仿提取部位(AC)、乙醇提取部位(AE)以及水提取部位(AW1、AW2)在模拟胃液条件下对NO2-的清除作用。结果表明。

内生真菌对离体培养的福建金线莲生长的影响

目的研究离体培养时瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.)真菌AR-15和AR-18对福建金线莲生长的影响。方法采用琼脂作支持物,考察真菌对福建金线莲鲜质量和增高的影响;采用蛭石作支持物,考察真菌和营养液对金线莲鲜质量和增高的影响。结果在琼脂培养基上,与对照相比,接菌AR-15和AR-18可使金线莲苗的增高分别提高97%和81.5%(P<0.01)。在蛭石基质上,真菌AR-15和蒸馏水组合极显著促进金线莲的增质量和苗的增高(P<0.01),分别是不接菌的3.26倍和1.51倍;真菌AR-15和营养液组合极显著促进金线莲增质量1.41倍(P<0.01),显著促进金线莲增高1.17倍(P<0.05)。真菌AR-18和蒸馏水组合极显著促进金线莲鲜质量的增加和苗的增高(P<0.01),分别是不接菌的3.86倍和1.45倍;真菌AR-18和营养液组合极显著促进金线莲增质量1.96倍(P<0.01),显著促进金线莲增高1.25倍(P<0.05)。结论在离体培养条件下,真菌AR-15和AR-18可促进福建金线莲的生长;在人工栽培金线莲的过程中,使用真菌AR-15和AR-18为菌肥,有可能取得较好的效果。

金线莲茎腐病病原菌分离及分子鉴定

采用组织块法对金线莲疑似茎腐病病原菌进行分离,用致病性试验、病原菌形态学观察、分子生物学方法对该病原菌进行鉴定。结果表明:从收集的金线莲疑似茎腐病病原菌感染植株中分离得到的菌株,在培养基中产生大量气生菌丝呈棉絮状,菌丝在培养基中产生紫色色素,有隔及分枝,大型分生孢子纺锤形,小型分生孢子卵形或长圆形。分离的菌株回接后可使金线莲植株产生病害,对扩增得到的rDNA-ITS序列进行Blast对比分析,确定该病害为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum Schl.引起的茎腐病。

金线兰种苗质量分级标准研究

探讨金线兰种苗质量分级标准。测定金线兰组培苗的苗长、叶长、叶宽、叶片数、茎粗、茎节数、单株重等数量指标,进行相关性分析、主成分分析,确定金线兰种苗分级指标,并根据聚类分析数据、标准差数据制定分级标准,采用成活率进行分级验证。结果表明,苗长、茎粗及单株重是金线兰组培苗分级的主要指标,金线兰种苗分为3个等级,一级种苗苗长≥130mm,茎粗≥2.8mm,单株重≥1.3g,二级种苗苗长≥110mm,茎粗≥2.4mm,单株重≥1.0g,三级种苗苗长≥90mm,茎粗≥2.1mm,单株重≥0.6g。该分级标准为金线兰种苗繁育以及生产提供有效的理论依据。