Sequence differences of rDNA-ITS2 and species-diagnostic PCR assay of Anopheles sinensis and Anopheles anthropophagus from China

Anopheles sinensis and An. anihropophagus are two morphologically indistinguishable yet genetically and behaviorally distinct mosquito species that vary dramatically in their importance as vectors of malaria inChina. The sequence of the ribosomal DNA internal transcribed spacer 2 (ITS2) was determined for bothspecies to assess the species differentiation. The lengths of ITS2 was 468 hp for An. sinensis and 452 hp forAn. anthropophagus. Interspecies difference in sequence was 28. 8%. Intraspecies sequence divergence wasnegligible. A PCR method was developed for distinguishing the two species based on the species-specific variations of the ITS2 sequences. The method would amplify a diagnostic fragment in length of 425 hp for An.sinensis and 253 hp for An. anthropophagus. Field collections from 12 localities in 10 provinces of China weretested. In 440 mosquitoes identified by adult morphological characteristics as An. sinensis, 291 (66. 2 % ) wereidentified later as An. sinensis and 56 (12. 7 % ) as An. anthropophagus, the remaining 93 (22. 1 % ) were notamplified by PCR. The results showed that the morphological characteritics of adult was not reliable for fieldidentification. The PCR assay was a simple, fast and reliable method for species identification.

PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究

目的 区别赫坎按蚊种团内近缘种。方法 应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法 (PCR- RFL P)技术 ,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性 ITS2 引物进行 PCR扩增 ,限制性内切酶 Rsa 和 Hinf 消化 ,琼脂糖凝胶电泳分析。结果 中华按蚊的 PCR扩增产物能被限制性内切酶 Rsa 酶切成 35 0 bp和 2 0 0 bp两条酶切 DNA条带 ;嗜人按蚊核糖体 DNA (r DNA)的 PCR扩增产物能被限制性内切酶 Hinf 酶切成 4 10 bp的酶切 DNA条带 ;雷氏按蚊的 ITS2 基因 PCR扩增产物能分别被限制性内切酶 Rsa 和 Hinf 酶切 ,分别显示 35 0 bp和 4 0 0 bp的酶切 DNA条带 ;八代按蚊的 PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶 Rsa 或 Hinf 酶切条带。结论 依据r DNA的 ITS2 区段基因特征建立的 PCR- RFL P技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊

中华按蚊和嗜人按蚊rDNA内转录间隔2区序列差异

目的：比较中华按蚊和嗜人按蚊核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）内转录间隔２区（ＩＴＳ２）序列差异。方法：通过对ＰＣＲ扩增的ｒＤＮＡＩＴＳ２片段进行克隆测序，每种蚊测定３个克隆片段序列，比较其差异。结果：中华按蚊和嗜人按蚊的ｒＤＮＡＩＴＳ２序列长度分别为４６８和４５２ｂｐ，ＧＣ含量分别为４４．８７％和４９．１２％，两者序列差异为２８．８％。

一种简便的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别新技术

目的 建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内不同近缘种按蚊的基因鉴别技术。方法 依据赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊 4种近缘种按蚊ITS2 区段的基因序列特征设计特异性引物 ,建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊 4种近缘种按蚊的简便的PCR基因鉴别技术 ,并采用传统的形态学分类方法和新建立的基因鉴别技术对从辽宁、河南省以及在朝鲜现场捕获的按蚊分别进行了形态学和基因鉴别及比较。结果与结论 新建立的基因鉴别技术能准确鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊 4种近缘种按蚊。具有比传统的形态学分类方法准确 ,比已有的PCR-RFLP蚊种基因鉴别技术更简便、价廉和省时的特点。

1989～2003年江苏省疟疾流行态势分析

目的 了解江苏省疟疾控制后的流行特点 ,为制定防治对策提供依据。方法 收集全省各县 1989～ 2 0 0 3年疟疾疫情资料 ,对不同年份、不同地区的发病率或阳性率进行相关分析或显著性检验。结果 全省疟疾疫情呈下降趋势 ,疫情出现波动与局部疟疾暴发有密切关系。 2 0 0 3年复媒介地区发病率为 0 .32 /万 ,单一中华按蚊区发病率为 0 .0 6 /万 ,前者发病率明显高于后者 (P<0 .0 1)。本地居民发热病例血检阳性率为 0 .0 6 % ,流动人口发热病人血检阳性率为 0 .5 5 % ,后者明显高于前者。间接荧光抗体 (IFA)阳性率与发病率呈正相关。结论 江苏省复媒介地区疟疾潜在流行的危险性仍较高 ,控制局部暴发点是当前的主要任务 ;必须加强对流动人口和媒介的监测力度。

用PCR-RFLP技术鉴别嗜人按蚊和中华按蚊的研究

目的 依据嗜人按蚊和中华按蚊rDNA的ITS2区段基因特征 ,建立一种新的嗜人按蚊和中华按蚊基因鉴别技术。方法 对不同地区的嗜人按蚊、可疑嗜人按蚊和中华按蚊样本通过采用特异性ITS2 引物PCR扩增 ,限制性内切酶RsaI和HinfI消化 ,以及琼脂糖凝胶电泳分析进行PCR -RFLP基因鉴别。 结果 不同地区嗜人按蚊rDNA的ITS2 基因PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfI酶切 ,并显示一条 4 5 0bp的酶切DNA条带 ;中华按蚊的ITS2 基因PCR扩增产物则能被限制性内切酶RsaI酶切 ,并显示 4 0 0bp和 2 0 0bp两条酶切DNA条带 ;辽宁可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与嗜人按蚊相同而广东珠海可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与中华按蚊相同。结论 依据rDNA的ITS2 区段基因特征建立的PCR -RFLP技术可用于嗜人按蚊和中华按蚊的基因鉴别。采用该PCR -RFLP基因鉴别技术发现辽宁可疑嗜人按蚊的基因与中国大陆的嗜人按蚊属同种 ,而广东可疑嗜人按蚊的基因与中华按蚊属同种。

广东省嗜人按蚊与中华按蚊疟疾传播强度的比较

目的比较广东省嗜人按蚊与中华按蚊疟疾传播强度,为控制疟疾爆发流行提供科学依据。方法采用按蚊密度调查等方法在广东省珠海市和惠州市进行媒介能量的调查和研究。结果广东省珠海市嗜人按蚊的媒介能量为5.863,中华按蚊为0.663;广东省惠州市嗜人按蚊的媒介能量为2.770,中华按蚊为0.249。结论嗜人按蚊的媒介能量是中华按蚊的8～11倍,说明嗜人按蚊在广东的传疟作用较中华按蚊更为重要,占主要地位。

四川省嗜人按蚊与中华按蚊对溴氰菊酯和二氯苯醚菊酯的敏感性测试

目的 了解四川省主要媒介按蚊对菊酯类杀虫剂的敏感性 ,为继续使用菊酯类杀虫剂控制媒介按蚊提供依据。方法 采用WHO推荐使用的接触筒强迫接触法 ,观察测试蚊虫死亡数 ,计算校正死亡率。结果 嗜人按蚊的校正死亡率平均为 10 0 % ,中华按蚊的校正死亡率平均为 90 .86%。结论 四川省仍可采用溴氰菊酯处理蚊帐灭蚊防疟。

嗜人按蚊和中华按蚊的ITS_2区段序列分析和比较

目的 分析和比较不同地区中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2区段的基因特征。方法 采用特异性ITS2引物对嗜人按蚊和中华按蚊江苏实验株以及从湖北省和越南现场捕获的嗜人按蚊和中华按蚊进行PCR扩增、克隆并对ITS2区段序列进行分析。结果 嗜人按蚊实验株的ITS2区段序列有452bp,与嗜人按蚊现场株的ITS2区段序列相同,中华按蚊实验株的ITS2区段序列有472bp,与中华按蚊现场株的ITS2区段序列也相同;但嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶位点。结论 可依据中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2基因序列内限制性内切酶切位点不同的基因特征,采用PCR-RFLP技术建立中华按蚊和嗜人按蚊基因鉴别技术。

套式PCR检测蚊体内疟原虫的研究

目的建立一种敏感、特异而快速的检测蚊体内疟原虫的方法。方法采用套式PCR方法,对人工感染间日疟原虫的嗜人按蚊、感染恶性疟和混合感染间日疟与恶性疟的大劣按蚊以及流行季节现场捕获的中华按蚊体内的疟原虫进行检测。结果28批人工感染间日疟原虫的嗜人按蚊、2批人工感染恶性疟的大劣按蚊和1批混合感染间日疟与恶性疟的大劣按蚊的检测结果与镜检结果符合率为100%;589只现场捕获的中华按蚊中,发现间日疟原虫阳性2只,阳性率为0.34%。结论本方法能快速而敏感地检出蚊体内不同种疟原虫。

中华按蚊和嗜人按蚊不同地理株基因组DNA的限制酶切长度差异(RFLDs)

我们制备了上海,广西和郑州三株中华按蚊,江苏和广西两株嗜人按蚊的基因组DNA,分别用BglⅡ,HaeⅢ和PstⅠ消化各基因组DNA,进行琼脂糖凝胶电泳再用溴乙锭染色后,观察比较同种按蚊各株间基因组DNA重复序列DNA的限制酶切长度差异.结果发现,各地理株间的酶切带型,既具有种的特征,即主带相同,稳定;又有株的特异性淡带。三株中华按蚊的PstⅠ,两株嗜人按蚊的BglⅡ的酶切长度差异可以将各地理株区别开来,比较观察限制酶切长度差异是分析种内各地理株变异的敏感可靠的方法.实验结果表明了中华按故三地理株,嗜人按蚊的两地理株间的重复序列DNA的结构有差异,从基因结构上证实了两种按蚊种下的分化。

发作期与间歇期间日疟原虫在不同按蚊体内发育差异的研究

目的比较临床发作期与间歇期间日疟原虫在中华按蚊和嗜人按蚊体内发育的差异。方法在我国间日疟流行区分别采集临床发作期与间歇期间日疟病例的血样,采用体外人工膜饲感染系统在实验室同时体外人工感染中华按蚊和嗜人按蚊,在感染后7-9d和14d分别解剖蚊胃和唾液腺,并检测蚊体内的卵囊和子孢子数。结果临床发作期间日疟原虫感染中华按蚊的卵囊阳性率和阳性蚊比率、子孢子阳性蚊比率和感染度均低于间歇期间日疟原虫感染,临床发作期间日疟原虫感染嗜人按蚊的子孢子阳性率、阳性蚊比率和卵囊阳性蚊比率均低于间歇期间日疟原虫感染,而子孢子感染度则高于间歇期疟原虫感染。结论临床发作期与间歇期间日疟原虫体外人工感染中华按蚊、嗜人按蚊卵囊和子孢子有差异。

应用rDNA ITS2区段基因序列分析对浙江省传疟媒介的鉴定

目的对浙江省传疟媒介种类进行鉴定,以指导疟疾防治工作。方法针对媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2(rDNAITS2)区段基因特征,应用PCR基因鉴别技术,对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp,与实验室中华按蚊标本一致。结论中华按蚊目前仍是浙江省的主要传疟媒介,现场调查未发现嗜人按蚊。

PCR技术在赫坎按蚊复合体近缘种鉴别中的应用

目的应用聚合酶链反应(PCR)技术分析湖北省不同地区媒介按蚊的种型。方法采用传统的形态学方法和新建立的基因鉴别技术对现场捕获的按蚊分别进行形态特征鉴别和基因鉴别及比较。结果现场捕获181只按蚊,形态学确认176只为中华按蚊,而PCR鉴定172只为中华按蚊,另4只为八代按蚊;经形态学特征鉴别的5只嗜人按蚊中,PCR鉴别有4只为嗜人按蚊,另1只为八代按蚊。结论采用PCR基因鉴别技术能准确鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊等近缘种按蚊,较传统的按蚊形态学鉴别方法准确,适用于复合媒介地区的疟疾媒介调查和监测。

四川省嗜人按蚊、中华按蚊的栖息习性和嗜血习性调查

目的 进一步了解嗜人按蚊和中华按蚊的栖息习性和嗜血习性及变化情况。 方法 选择不同类型栖息场所进行按蚊密度调查 ,在人房、牛房分别安装外逸窗阱观察蚊虫外逸情况 ,采取全捕法将人房、牛房、猪房内捕获的吸血蚊作胃血沉淀试验。 结果 人房、牛房、猪房中的嗜人按蚊密度分别为 3 .3 5、18.2 5和 9.3 8只 /人工小时 ;人房、牛房、猪房的嗜人按蚊平均数分别为 0 .63、9.5 5、1.68只 /间。人房、牛房及猪房中的中华按蚊密度分别为 2 .72、88.86、61.2 5只/人工小时 ;人房、牛房、猪房的中华按蚊平均数分别为 0 .3 2、3 3、3 .78只 /间。胃血沉淀试验 ,人房中的嗜人按蚊吸人血率为 94.5 7% (87/92 ) ,牛房为 5 .0 4% (6/119) ,猪房为 6.15 % (4 /65 )。中华按蚊吸人血率在人房、牛房和猪房分别为11.43 % (4 /3 5 )、3 .17% (2 /63 )和 0。 结论 嗜人按蚊和中华按蚊的主要栖息场所为牛房 ,其次为猪房和人房。嗜人按蚊主要嗜吸人血 ,中华按蚊则嗜吸其它动物血。

rDNA ITS2区段基因序列分析技术用于江苏省疟疾疫情不稳定地区传疟媒介的鉴定

目的了解江苏省近年来疟疾疫情回升地区媒介按蚊种类。方法采用rDNA ITS2区段基因序列分析技术,对半通宵室外人饵诱捕法和清晨蚊帐内捕蚊法捕获的现场按蚊进行蚊种鉴定。结果经形态学鉴定和PCR基因扩增,并与实验室模式种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊DNA基因比较,现场捕获的按蚊均为中华按蚊。结论中华按蚊仍是目前江苏省疟疾疫情回升地区的主要传疟媒介。

嗜人按蚊和中华按蚊实验种群寿命的比较观察

本文应用简略寿命表的方法在现场实验室内对嗜人按蚊和中华按蚊实验种群的寿命作了比较观察.嗜人按蚊雌、雄蚊的期望寿命分别为16.75d和15.91d,中华按蚊雌、雄蚊分别为21.63d和17.51d.两种按蚊雌蚊期望寿命都足够疟原虫在蚊体内完成孢子增殖.

氟氯氰菊酯浸帐防制疟疾媒介按蚊的效果观察

目的 观察氟氯氰菊酯浸帐防制疟疾媒介按蚊效果。 方法 在疟疾暴发流行点 ,以 12 .5 %氟氯氰菊酯水乳剂按 15mg/m2 帐面的剂量 ,对居民的蚊帐实施浸泡 ;定时、定点室内晨间帐内、室外人诱和猪舍内捕蚊观察按蚊密度 ;通过疟史调查了解疟疾发病情况。 结果 浸帐后连续 2年居民帐内嗜人按蚊和中华按蚊密度分别较浸帐前下降了10 0 .0 0 %和 99.93 %。浸帐当年未浸泡居民帐内仍可捕到两种按蚊 ;室外人诱及猪舍内嗜人按蚊密度有所回升 ,但室外人诱该蚊占按蚊的比率显著下降。第 2年后两种捕蚊方法未再捕到嗜人按蚊 ,而中华按蚊则维持较高密度 ,显示浸帐对降低中华按蚊种群数量的效果不佳。疟疾发病率从浸帐前 (1999年 )的 2 1.0 1%下降至 2 0 0 1年的 1.3 8%。 结论 一次氟氯氰菊酯浸泡蚊帐 ,可明显降低嗜人按蚊密度 ,能有效控制疟疾的暴发流行。

按蚊rDNA ITS2区段基因序列检测

目的鉴定浙江传疟媒介种类,为制定浙江省疟疾防治策略提供依据。方法利用媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2(rDNA ITS2)区段基因特征,应用PCR基因鉴别技术,对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp,与实验室中华按蚊标本一致。结论浙江省的传疟媒介是中华按蚊,现场调查未发现嗜人按蚊。

两种按蚊共存地区控制间日疟效果的纵向观察

为探索进一步控制和降低两种按蚊共存地区间日疟发病率的措施，选择六合县马鞍乡为纵向观察试点，采取灭蚊与传染源查治措施的不同组合，观察１９９１～１９９６年的年发病率、发热病人血检阳性率、小学生疟原虫阳性率、间接荧光抗体（ＩＦＡ）阳性率、按蚊种群比例和密度等指标的变化情况。结果在采取灭蚊措施时，年发病率出现明显下降；当无灭蚊措施时，则发病率回升。发热病人血检阳性率、ＩＦＡ阳性率和年发病率的变化基本吻合。结果表明：两种按蚊共存地区，采取灭蚊措施能有效地控制间日疟发病率，除年发病率外，发热病人血检疟原虫阳性率和ＩＦＡ阳性率也可用于评价不同防治措施的效果。