藜麦CqANS基因的克隆及表达分析

【目的】通过藜麦ANS基因生物信息学分析,研究其蛋白相关特性,为进一步阐明藜麦CqANS基因发挥作用的分子机制提供基础。【方法】通过PCR反应克隆藜麦ANS基因(CqANS)的cDNA全长序列,进而对CqANS编码的蛋白质序列及特征进行预测分析,同时利用实时定量PCR对该基因在不同胁迫处理下的表达进行分析。【结果】藜麦ANS基因包含2个外显子和1个内含子,其编码的蛋白质编码359个氨基酸残基;藜麦CqANS蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,蛋白质定位于细胞质;其属于PLN03178超家族,具有典型的Fe2+-依赖的双加氧酶家族(2OG-FeII_Oxy)的保守结构域。启动子分析显示在CqANS上游启动子区域存在多种响应非生物胁迫的顺式作用元件。低温胁迫诱导CqANS的表达,而外源ABA处理及干旱处理则抑制CqANS的表达。CqANS与包括AUR62014624-RA在内的多个蛋白存在互作关系。【结论】藜麦ANS基因(CqANS)具有ANS基因家族特征,可能与其他植物的ANS基因存在相似的生物学功能。

比利时杜鹃花花青素合成酶基因(RhANS)克隆及其功能分析

花青素合成酶(ANS)是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录(RT-PCR)和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱(Waters UPLC-Qtof)技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体(pET-28a)上,并在大肠杆菌(BL21)中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱(HPLC)检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1350 bp,开放阅读框(ORF)序列1074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官(根、茎和叶)中均表达。不同花发育时期RhANS表达量与花青素含量呈上升趋势;通过大肠杆菌原核表达载体诱导表达出大小约为40 kDa的蛋白,与理论值相近。高效液相色谱仪(HPLC)检测表明,目的蛋白具有ANS酶活性。本研究为杜鹃花中花青素生物合成的分子调控机理提供了理论依据。

滇牡丹PdANS的克隆、表达及与花青素含量的相关性

花色是观赏植物最重要的品质性状之一,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。探明滇牡丹的花色调控机理,为提高观赏价值奠定理论基础。以花瓣为材料,克隆获得PdANS,生物信息学分析其特征,结合实时荧光定量PCR、HPLC等技术探究不同组织、不同发育时期中PdANS的表达情况与各组织花青素含量的相关性。结果表明,PdANS全长1 121 bp,包含一个1 064bp的开放阅读框(ORF),编码354个氨基酸,相对分子质量40.41 kD,理论等电点(pI)5.48,分子式为C_(1819)H_(2876)N_(474)O_(540)S_(12),脂肪指数为88.64,不稳定指数(Ⅱ)为55.32,亲水平均数为-0.435,推测为不稳定的亲水蛋白。且无信号肽序列及跨膜螺旋区,是没有分泌功能的非跨膜蛋白。系统进化分析显示,滇牡丹PdANS与牡丹、芍药等植物的ANS蛋白亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,PdANS在花瓣、花药、萼片、苞片和花梗中均有表达,以花瓣中的表达量最高。HPLC结果表明,在不同组织提取液中,分别检测出Cy3G5G、Pn3G5G、Cy3G和Pn3G四种花青素,且花青素含量花瓣>花药>萼片>花梗>苞片。相关性分析表明,花青素含量与PdANS表达量呈极显著相关性。推测PdANS在滇牡丹花色的形成中扮演着重要角色,参与花青素物质的生物合成。

三华李ANS基因克隆及其在果实采后转色过程中的表达分析

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是参与植物组织花青素合成的关键酶。果肉富含花青素是三华李果实的显著特色。本研究首次克隆得到三华李ANS全长cDNA,将其命名为PsANS,并对其在不同组织和果实成熟转色过程中的表达模式进行分析。结果表明,PsANS编码区长度为1074 bp,包含一个长度为217 bp的内含子,可编码一个包含357个氨基酸、分子量为40401.37的蛋白质;该蛋白二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主,亚细胞定位于细胞质中。蛋白互作预测发现,含有ANS结构域的蛋白主要与TT4、DFR、UF3GT、F3H、TT8等存在互作关系。不同植物的ANS蛋白同源性较高,均包含相似的蛋白催化位点;PsANS与同属蔷薇科的欧洲李ANS蛋白的亲缘关系较近。PsANS在不同组织中表达差异较大,果肉中表达量最高。三华李后熟转色过程中PsANS表达呈上升趋势,乙烯处理进一步上调了PsANS的表达,表明PsANS对三华李果实发育和后熟过程中花青素的合成起着重要作用。

不同花色油菜ANS基因的克隆及表达分析

在克隆5种不同花色油菜材料中ANS基因的基础上,对克隆的ANS基因序列进行了比较,对ANS基因不同拷贝cD-NA全长做了半定量PCR分析。结果显示,ANS基因的BnaA01g12530D和BnaC01g14310D拷贝在不同花色油菜中的序列和参考序列完全一致,并且在不同花色油菜花瓣中的表达也未见明显差异,而BnaA03g45610D和BnaC07g37670D拷贝在不同花色油菜中则呈现出序列多样性,并且其在红色和橙色油菜材料花瓣中的表达量与其他花色油菜相比差异明显。

疏水性蛋白荧光探针Bis-ANS的合成

疏水蛋白荧光探针8,8’-二苯胺基-5,5’-二磺酸联萘(bis-ANS)是研究蛋白质结构及观察其行为的重要工具。以8-苯胺基-1-萘磺酸铵(ANS)为原料:氧化偶联合成了bis-ANS,通过摸索寻找到一种优良的分离方法,并研究了溶剂、温度对收率的影响,目标产物结构经过核磁共振(1H NMR)1、3CNMR和质谱(MS)确证。

不同植物LDOX/ANS基因的生物信息学分析

花青素是一类重要的植物次生代谢产物。本文采用生物信息学的方法对已在GenBank上登录的拟南芥、西洋梨、苹果、桃、葡萄、芥菜、菊花新品种和水稻等植物的无色花青素双加氧酶/花青素合成酶(LDOX/ANS)基因的核酸及氨基酸序列、组成成分、导肽、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级结构、三级结构及功能域等进行预测和推断。结果表明,ORF除了桃和菊花新品种为500bp左右之外,其它几种植物都在1070bp左右,分子量均为4kD左右,理论等电点均低于7,说明LDOX/ANS呈酸性。Glu、Leu和Val是这些植物共有的主要氨基酸。核苷酸同源性比对结果显示,拟南芥LDOX/ANS与其它植物LDOX/ANS的同源性较高;8个物种的LDOX/ANS基因被分为两个大类,单子叶植物水稻LDOX/ANS基因被单独分为一类,其它的均聚成一大类。研究还发现这些植物的LDOX/ANSN端不存在导肽和信号肽,无跨膜结构域,肽链表现为亲水性。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,包含一个20G-FeⅡOxy功能结构域。通过此次研究,希望为今后深入研究该类酶的功能和结构特征提供依据。

凤丹牡丹ANS(PoANS)基因克隆、特性及表达

通过RT-PCR技术,从凤丹牡丹花瓣中克隆出编码ANS基因的c DNA序列,并对其进行生物信息学分析。对不同开花阶段的凤丹花瓣进行实时荧光定量及总花青素质量分数测定,构建原核表达载体PET-28aANS,并转化大肠杆菌BL21感受态,经IPTG诱导进行体外表达。结果表明:该序列编码区域共1 065 bp,编码354个氨基酸,其蛋白相对分子质量为40 475.5,亚细胞定位为细胞质的可能性最大;表达分析显示,ANS基因表达水平与不同开花时期的总花青素质量分数及花色相关,原核表达得到相对分子质量约为44 000的ANS-His-tag融合蛋白,与预测蛋白大小相一致。

芒果ANS基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果果实中ANS基因的功能。利用同源克隆方法从芒果果实中克隆得到了一个ANS基因,该基因的c DNA长度为1 252 bp,开放阅读框的长度为1 056 bp,编码351个氨基酸。通过系统发育分析,发现该基因编码的蛋白与荔枝、葡萄、可可豆、桑树等聚在一类。通过序列对比分析表明,已经成功得到芒果ANS基因,并对其生物信息进行了分析,为下一步芒果ANS基因的功能研究打下了基础。

荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。

龙眼花芽ANS基因的克隆与原核表达

运用蛋白质组学比较龙眼(Dimocarpus longan Lour.)正常成花和成花逆转花芽的蛋白质组变化,结果表明,ANS蛋白(anthocyanidin synthase)在龙眼成花逆转花芽中下调表达。应用RACE方法克隆ANS蛋白的全长cDNA,长度为1477 bp,包括1个1071 bp的开放阅读框,编码357 bp的氨基酸序列,GenBank的登录号为FJ479616(GI:218202927)。将ANS在大肠杆菌中表达,获得1个约46 kD的外源蛋白。这说明ANS蛋白在龙眼成花逆转过程中起作用。

不同肉质颜色萝卜ANS基因表达差异分析

为了解不同肉质颜色萝卜ANS基因的表达量与萝卜色素含量的关系,以16份不同肉质颜色萝卜为材料,采用荧光定量PCR法检测cDNA样本中的ANS基因表达量,同时测定萝卜肉质根的色素含量,分析萝卜色素含量与ANS基因表达量的相关关系。结果表明,16份不同肉质颜色萝卜间色素含量存在极显著差异(F=114.2940,P=0.0001)。其中,红皮红心萝卜肉质根色素含量(23.80‰)显著高于白皮白心萝卜色素含量(0.10‰);16份不同肉质颜色萝卜ANS基因表达量也存在极显著差异(F=95.9840,P=0.0001),其中,红皮红心萝卜ANS基因表达量最高(6.4390),白皮白心萝卜ANS基因表达量最低(0.1268)。相关分析结果表明,萝卜ANS基因表达量与萝卜色素含量的相关系数为0.83,且达到极显著水平。ANS基因可能是萝卜色素合成的关键结构基因。

胰蛋白酶与ANS的相互作用

利用荧光光谱法研究了在不同ｐＨ、压力及不同浓度的脲作用时荧光探针１，８－ＡＮＳ（１－ａｎｉｌｉｏｎｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－８－ｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）与胰蛋白酶的相互作用．发现在低ｐＨ时ＡＮＳ可以结合到胰蛋白酶上，其中以ｐＨ２．０、３．０时结合最强．进一步的研究发现脲变性对胰蛋白酶结合ＡＮＳ的能力有很大的影响：１．５ｍｏｌ／Ｌ的脲即可使得胰蛋白酶结合ＡＮＳ的能力大大降低，但有趣的是即使高达４ｍｏｌ／Ｌ的脲对胰蛋白酶色氨酸残基荧光也无明显影响．另外，在ｐＨ猝变、脲变性、及逐渐改变压力时，胰蛋白酶色氨酸残基荧光和结合到胰蛋白酶分子上的ＡＮＳ的荧光的变化大不相同．上述结果暗示胰蛋白酶的色氨酸残基所在的区域和其结合ＡＮＳ的区域是两个不相同的区域．

洋葱ANS基因启动子的克隆与瞬时表达分析

通过PCR方法对洋葱花青素合成酶基因(AcANS)上游启动子序列进行扩增,获得长度为1.8 kb和2.2 kb的两种片段,命名为ANSPM1和ANSPM2。序列分析表明,克隆到的两个启动子除含有多个TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件,还含有与MYB转录因子结合的元件,以及参与光响应、逆境、激素应答的顺式作用元件。同时构建ANSPM1和ANSPM2驱动GUS报告基因的植物表达载体,通过洋葱表皮细胞瞬时表达分析,表明两个启动子均有活性。

黑芥ANS基因的克隆和在芸薹属B基因组的PCR鉴别

利用同源克隆方法克隆黑芥ANS基因,获得2个ANS基因拷贝BnANS1和BnANS2,长度分别为1 366bp和1 367bp。这2个基因都有1个76bp的内含子。比较BnANS1和BnANS2基因序列,发现在编码区、5’与3’非编码区和内含子区域都有多态性,5’非编码区有3个碱基的多态性和4个碱基的缺失,编码区有26个碱基的多态性;内含子有2个碱基的多态性;3’非编码区有18个碱基的多态性和3个碱基的插入。这2个ANS拷贝都编码356个氨基酸的蛋白,具有其他物种同样的ANS蛋白保守结构域,属于2OG-Fe(II)加氧酶超家族。BnANS1编码的蛋白质理论分子量为40 448.58Da,等电点为5.05;BnANS2编码的蛋白质理论分子量为40 468.52Da,等电点为5.04。比较这2个ANS基因拷贝编码的蛋白质序列,发现有9个多态性位点。这2个ANS拷贝在黑芥的种皮和胚中均检测到表达。获得了1对ANS引物,能从白菜、黑芥、甘蓝、芥菜型油菜、甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥中,用等位特异PCR方法特异识别来自芸薹属B基因组的ANS基因。

ANS活性在乳鼠心房肌细胞KAch通道表达中的作用

目的探讨ANS活性在乳鼠心房肌细胞KAch通道表达中的作用。方法在2015年9月~2016年9月,选60只实验用大鼠,分为去甲肾上腺素组和对照组,去甲肾上腺素组利用去肾上腺素干预,对照组仅应用生理盐水;使用实时荧光定量RT-PCR检测二组大鼠乳鼠心房肌细胞的Kir 3.1、Kir 3.4 m RNA的转录水平。结果 ANS活性和乳鼠心房肌细胞KAch通道上Kir 3.1、Kir 3.4 m RNA表达水平之间存在着相关性。结论 ANS活性影响乳鼠心房肌细胞KAch通道上很多因子的表达水平。

ANS-OB精炼终点温度预报模型

分析了ANS-OB精炼终点钢液温度的影响因素,包括吹氧、吹氩、合金添加情况和钢包状况等。基于理论分析和现场经验数据,建立了ANS-OB精炼终点温度预报模型。对于66炉次的实际生产数据,采用所建立的数学模型计算精炼终点温度,计算偏差在±5℃以内的精度达到80%,±7℃以内精度达到96%,±10℃以内精度达到100%。

听神经瘤量化ANS分级及其临床意义

目的 探求听神经瘤手术的科学、实用的分级方法,量化手术难易程度并对预后作出较为准确的估计,为临床治疗提供帮助.方法 选取142例经手术治疗的听神经瘤患者,术前均行MRI及CT影像学检查.据影像学肿瘤的大小、与中线的距离、颅神经受累的条数、与脑干的关系、与基底动脉的关系5个方面进行记分,根据总分进行ANS手术分级;将分值大小与手术切除率及术后并发症进行统计学分析.结果 A,B级肿瘤均行肿瘤全切;C级全切53例,全切率84.1%;D级全切37例,全切率67.3%.A,B级于C级、D级呈显著差异（P〈0.05）.术后出现新发颅神经损伤（不包括听神经）、肢体功能受限、共济失调及面神经功能（术后10d左右）较术前加重等并发症,A级0例;B级7例（31.8%）;C级36例（57.1%）,D级42例（75.0%）.结论 ①随着ANS分级增高,手术全切率明显下降（P〈0.05）.②随着ANS分级增高,出现新发颅神经损伤（不包括面听）、肢体功能受限、共济失调及面神经功能较术前加重等术后并发症明显增多（P〈0.05）.

ANS活性在乳鼠心房肌细胞Ca-L和KAch通道表达中的作用

目的:探讨ANS活性在乳鼠心房肌细胞Ca-L及KAch通道中的表达作用。方法:实验与2014年9年开始截止到2017年7月,选取60只实验乳鼠随机分为低药物浓度组和高药物浓度组,每组各30只;低药物浓度组NE 0.1μmol/L,Ach 0.1μmol/L;高药物浓度组NE 10μmol/L,Ach 10μmol/L进行干预。应用实时荧光定量RT-PCR和免疫组化α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)染色鉴定心肌细胞。进行检测2两组大鼠乳鼠心房肌细胞中的L型钙通道(Ca-L)和乙酰胆碱敏感钾通道(KAch)相关基因和蛋白表达。结果:研究显示,ANS活性与乳鼠心房肌细胞Ca-L及KAhc通道的表达转录水平呈正相关性。结论:ANS活性在乳鼠心房肌细胞Ca-L和KAch通道中影响了诸多因子的水平表达。

稀土Ce(Ⅲ)对辣根细胞膜蛋白-ANS复合体系的影响

稀土元素具有明显的生理调控特性，但其调控的机理未成研究明晰。尤其是细胞学机理不清晰。针对这些问题开展稀土植物生物无机化学方面的研究】二作是十分必要的，而探索宏观生命现象的细胞学机制则成为稀土研究的重点。细胞膜上的膜蛋白是外源性物质作用的靶点之一，且它们在细胞的正常生理活动中发挥着非常重要的作用。鉴此，本文以经济作物辣根为研究对象，以ANS为荧光探针（荧光探针ANS在极性条件下不发任何荧光，但与非极性区域结合后发出强烈荧光），运用荧光显微镜为工具，探讨Ce（Ⅲ）对辣根细胞膜蛋白一ANS复合体系的影响。