SYNTHESIS OF GENE FOR ANTIBACTERIAL PEPTIDE D FROM CHINESE OAK SILKWORM (Antheraea pernyi)

The antibacterial peptide D (ABP-D) was induced from the haemolymph of the Chinese oak silkworm (Antheraea pemyi). It has a marked inhibition effect on some human, insect and plant pathogenic bacteria. In order to synthesize a large amount of ABP-D in microorganism by recombinant DNA technology, here we report the synthesis of the ABP-D gene.

柞蚕抗菌肽D杀菌机理研究

本文研究柞蚕抗菌肽D对水稻白叶枯病细菌及番茄、烟奇、马铃薯青枯病细菌的杀菌作用及其机理。在37°C,pH6.8条件下,最低有效剂量2ng/1×10~5活菌。通过电镜观察,抗菌肽D对大肠杆菌及白叶枯病细菌的作用,首先使其外壁层及细胞质膜损伤,尤以菌体两端更为明显。此后形成喇叭状缺口,内容物呈囊状挤出胞外而致死。抗菌肽作用的菌体表面形成微管通道,钾离子大量渗出,但菌体外形在短时间内不致崩坏。

农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入烟草的研究

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能,对烟草等茄科作物的青枯病假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)具有较强的杀菌效果。人工合成抗菌肽基因(122 bp)转入根癌农杆菌(Agrobnctcrium tumefaciena),感染烟草叶盘,诱导成苗。通过对卡那霉素敏感筛选,胭脂碱脱氢酶检定及抗菌肽片段探针杂交,确认抗菌肽基因已转入烟草。现正研究其在烟草中表达及抗青枯病的可能性。

柞蚕抗菌肽的分离纯化及杀菌效应

大肠杆菌 (E .coliK12 D3 1)诱导的柞蚕 (Antheraeapernyi)蛹血淋巴 ,经加热处理后 ,进行CM -Sepharose阳离子交换层析 ,FPLCPepRPC反相柱及HPLCHi-PoreC18反相柱层析 ,纯化得到一类抗菌肽 .SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其相对分子质量约为 2 4 0 0 ,氨基酸组成分析表明其富含赖氨酸、丙氨酸和甘氨酸 ,摩尔分数分别为 18 6 %、15 5 %和 13 6 % ,不含甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和组氨酸 .

Lactoferricin B基因与几种变异克隆的构建及其在酿酒酵母中的表达与鉴定

目的构建牛乳铁多肽(Lactoferricin B)的真核表达质粒pYES2/Lactoferricin B,实现其在酿酒酵母S.cerevisiae中的表达,并初步检测其不同变异的体外抗菌活性。方法通过分别合成Lactoferricin B基因两条单链的部分序列,让其互为模板、引物进行PCR扩增,得到Lactoferricin B与3种变异的基因序列。将它们克隆到穿梭质粒pYES2中,构建pYES2/Lactoferricin B及3种变异基因重组质粒,转化到大肠杆菌Top10中,让其大量增殖。提取重组质粒经纯化后将其转化到S.cerevisiae中,通过营养缺陷型筛选获得重组酵母菌并通过半乳糖诱导使其表达目的蛋白。经离子交换柱纯化收集目的蛋白后,通过体外抑菌实验比较Lactoferricin B及3种变异重组蛋白的抗菌活性。结果经PCR扩增检验、DNA测序表明成功构建pYES2/Lactoferricin B与3种变异基因重组质粒。提取诱导后的蛋白进行SDS-PAGE电泳及质谱检测,证实目的蛋白的存在,相对分子质量约为3.4×103。在大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的抑菌实验中观测到Lactoferricin B和A17-Lactoferricin B产生了抑菌圈。结论成功构建pYES2/Lactoferricin B及变异基因重组质粒,该重组质粒能在S.cerevisiae中诱导表达目的蛋白,为进一步研究其生物功能及抗菌活性奠定了基础。

柞蚕抗菌肽对水稻白叶枯病菌的抑制作用

柞蚕蛹诱导含抗菌肽的免疫血淋巴,对水稻白叶枯病病原细菌(X(?)(?)pv (?))有明显的抑菌作用,对中国白叶枯病菌Ⅳ群强致病力菌株(RX77)的抑菌圈直径达12mm。电镜观察抗菌肽作用于白叶枯病菌能使其细胞膜破坏,内容物渗出而致死亡。处理10～30min即有效果。将抗菌肽与白叶枯病菌按不同比例混合后接种于水稻秧苗及孕穗期的叶子上,20天后调查病斑平均长度,经方差分析认为抗菌肽对病菌致病力有显著的减弱作用。

柞蚕新型抗菌肽moricin基因的克隆与分析

根据已知的抗菌肽moricin核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物,利用PCR方法克隆得到柞蚕新型抗菌肽moricin.该序列长度为126bp,将该序列克隆到pUCm-T载体.通过测序鉴定了柞蚕moricin的核苷酸序列,其核苷酸序列与家蚕moricin II的相似性为99.21%.根据核苷酸序列推算的柞蚕氨基酸序列与家蚕moricin II和mori-cin I的相似性分别为97.62%和95.24%.无论柞蚕moricin的核苷酸还是氨基酸序列都与家蚕moricin相似,说明它们属于同一抗菌肽家族,柞蚕核苷酸序列已在美国国立生物技术信息中心登录,登录号为DQ519400.

柞蚕抗菌肽D转基因酵母的培养及表达产物的分析

采用碱金属法（醋酸锂盐），以大肠杆菌－酵母穿梭质粒表达载体在酵母中表达人工合成的柞蚕抗菌肽Ｄ基因。用电泳及抗菌肽活性检测法对表达产物进行分析。同时还研究了转基因酵母的发酵条件，如温度、ｐＨ及营养等对酵母表达的影响。试验结果表明转基因酵母表达产物为１．１４ｍｇ／Ｌ培养液，杀菌活力为０．２１６单位。

柞蚕抗菌肽D基因在酵母中表达的研究

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能，人工合成抗菌肽Ｄ基因（１２２ｂｐ）与含α－因子及前导肽序列的穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２重组，克隆于酵母ＡＢ１０３。在缺亮氨酸的ＹＥ培养基中筛选Ｌｅｕ＋阳性的转化子。转化子菌株培养扩增后提取重组质粒与抗菌肽基因片段探针作点杂交为阳性，电泳后插入含抗菌肽Ｄ基因１２８ｂｐ的区带。在转基因酵母的发酵液中分离上清液，浓缩，对抗菌肽敏感的指示菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１有明显抑菌效应。证实人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因在酵母中表达。

柞蚕蛹抗菌肽D对大肠杆菌K_(12)D_(31)的作用

本文报道了不同浓度的柞蚕蛹抗菌肽D,对大肠杆菌KD的杀灭作用动力学。在LEG培养液中,抗菌从D的浓度在5微克/毫升时显效。浓度在10微克/毫升以上时,其杀菌速度大于细菌的增殖速度。固定抗菌肽浓度为10微克/毫升,细菌浓度在3×10^(7)个细菌/毫升,培养在磷酸钾盐缓冲液中,4小时后能全部杀灭。同样浓度细菌在LEG培养液中,4小时后细菌数下降到约为10^(2)个细菌/毫升,但不能全部杀灭。同时还提供了柞蚕蛹抗菌肽D和B对大肠杆菌KD作用不同时间的电镜照片。

柞蚕资源在医药健康领域研究现状及应用前景分析

柞蚕作为传统的动物药在我国有着悠久应用历史,随着现代科学技术的不断进步,柞蚕类产品在重大疾病防治及保健产品开发方面,引起学者的极大关注并获得显著进展。目前,柞蚕类原料多以复方制剂入药,对肾病综合征、乙型肝炎、前列腺肥大、更年期综合征等有临床治疗功效,可增强免疫力、缓解体疲劳、辅助降血糖、辅助降血脂等。同时,大量围绕柞蚕不同形态、不同适应证的研究取得新的成果。柞蚕抗菌肽具有热稳定性强、抗菌谱广、可杀伤癌细胞的特点,有望开发出新一代单体药物。该类产品在临床应用方面有待深入探讨,应遵从中医药综合调理全面论治理论,侧重从调动人体自身免疫方面,发挥柞蚕类药物的治疗预防作用。本文从以上几方面综述柞蚕类药品、保健品的最新研究进展,分析其当前研究应用中存在的问题、解决思路及应用前景。