应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫

采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增,结果2对引物分别扩增出1条大小不同的特异谱条带,其中用引物N1/N2扩增可检测出0.47ng的DNA模板。应用同样的PCR引物、体系和反应条件,可有效扩增出受感染柞蚕幼虫、成虫中的微孢子虫基因组DNA条带。该项检测技术有望应用于柞蚕微粒子病的早期诊断。

抗生素对柞蚕蛹期软化病3个病原菌菌株的抑菌试验

以柞蚕[Antheraea pernyi Guérin-Méneville(Lepidoptera:Saturniidae)]蛹为替代寄主繁殖白蛾周氏啮小蜂[Chouioia cuneaYang(Hymenoptera:Eulophidae)]技术在我国美国白蛾[Hyphantria cunea(Drury)(Lepidoptera:Arctiidae)]生物防治中发挥了重要作用。利用柞蚕蛹繁殖白蛾周氏啮小蜂时,蚕蛹健康对繁蜂数量和质量至关重要,而软化病是导致繁蜂失败的一种常见病害。为了保证蚕蛹健康、降低病原细菌对繁蜂的不良影响。本研究利用抗生素对繁蜂时常见的黏质沙雷氏菌[Serratia marcescens Bizio(Enterobacteriales:Enterobacteriaceae)]C1、C2和C3菌株进行体外抑菌试验和体内抑菌试验。结果表明,筛选出杀菌效果好的抗生素种类及使用浓度为卡那霉素10U.mL-1、庆大霉素200U.mL-1或链霉素2.0×104U.mL-1;对蚕蛹体内注射上述种类和浓度的抗生素(每个蛹内注射0.1mL)后接蜂,小蜂的生存几率增加,其寄生成功率分别提高69.16%、36.95%和69.24%。可见,即使采用效果最好的抗生素注射预防,仍有大约30%蚕蛹因发生细菌病害而使小蜂败育。

柞蚕核型多角体病毒病及其防治方法的研究进展

柞蚕核型多角体病毒,是柞蚕血液型脓病的病原。对柞蚕的侵染途径主要通过食下和体壁创伤进行。目前已建立柞蚕核型多角体病毒载体表达系统,并分别在体内、体外表达了报告基因。鸡免疫卵黄抗体是一种新型饲料添加剂,已用作促进畜禽生长、繁殖和防治疾病,进行蚕病防治的探索性研究,为有效防治蚕病提供了新的思路。

柞蚕生产防病消毒技术

做好严格消毒,杜绝病源,对增强幼虫体质,提高抗病力,可有效的预防脓病、软化病的发生。卵面消毒可采用甲醛液或盐酸甲醛混合液,配制3%甲醛液和配制3%盐酸甲醛混合液,药液温度为25℃,消毒时间30 min,然后采用药液温度相同的清水脱药漂洗2～3次。

柞蚕抗菌肽D基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究

通过二次正交旋转组合设计对尾叶桉叶盘愈伤组织分化培养基优化 ,获得尾叶桉 (Eucalyptusuro phylia)叶盘外植体的再生植株。将携带外源目的基因的根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)与尾叶桉U6无性系叶盘共培养 ,经愈伤组织诱导、卡那霉素筛选和植株再生 ,获得 2 0个小芽 ,再将小芽转入附加卡那霉素(Kam) 4 0 μg·mL- 1 的E3-B培养基中诱根 ,获得 8株存活且可再生的转化子。取转化苗叶片作胭脂碱合成酶活性检测电泳后呈阳性 ;分别以γ 32 p dCTP及地高辛标记柞蚕抗菌肽D基因作探针 ,与转化苗DNA作点杂交及Southern印迹杂交检测 ,结果均呈阳性。以上结果表明 ,柞蚕抗菌肽D基因已整合到尾叶桉基因组中。将从桉树青枯病重病区分离的强毒青枯菌 (Pseudomonasspp .)株 (9910 16 )以 1× 10 9cfu·mL- 1 浓度接种转化试管苗 ,以未经转基因的尾叶桉U6 无性系试管苗为对照 ,结果表明转化苗接种死亡率 5 6 7% ,对照死亡率为 86 7% 。

生物农药在柞蚕病害防治中的应用现状分析

概述了生物农药的种类、特点及其研究现状,介绍了利用微生物防治蚕病的研究进展,分析了微生物农药在柞蚕病害防治中的应用前景。

应用16SrRNA基因序列鉴定柞蚕空胴病病原菌

20世纪70年代末,采用形态分类学方法,将引起柞蚕空胴病的致病菌鉴定为柞蚕链球菌(Streptococcus pernyi sp.nov)。分别提取已分离柞蚕空胴病的5株病原菌株的基因组DNA,PCR扩增16S rRNA基因片段,经克隆、测序后,与GenBank中登录的相关肠球菌、链球菌菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比对并构建系统进化树。结果表明,供试的5株菌株的16S rRNA基因序列相似性在99.5%～99.9%之间,相互之间存在着10个可变位点,推测5株菌株属于同一个菌种;5株菌株的16S rRNA基因序列与肠球菌属(Enterococcus)16S rRNA基因序列的相似性较高,在92.4%～99.8%之间,而与链球菌属(Streptococcus)16S rRNA基因序列的相似性相对较低,在87.3%～87.8%之间;5株菌株与肠球菌属在系统进化树上聚为一类。基于菌株的16S rRNA基因序列分析,鉴定柞蚕空胴病的病原菌应归属于肠球菌属。

柞蚕微粒子病潜在生物标志物的挖掘

【目的】挖掘柞蚕Antheraea pernyi微粒子病的潜在生物标志物,为开发该病害检测方法及研究柞蚕被微孢子虫Nosema pernyi侵染后体内代谢产物的差异及功能奠定基础。【方法】利用高效液相色谱和高分辨率质谱进行非靶向代谢组学分析,调查健康和患微粒子病柞蚕雌成虫血淋巴中代谢物差异。【结果】正离子模式下从健康和患微粒子病柞蚕雌成虫血淋巴中共获得8870个代谢物,注释代谢物5390个,筛选到差异表达代谢物472个(上调260个,下调212个),其中二级鉴定差异表达代谢物12个(上调8个,下调4个);负离子模式下获得6716个代谢物,注释代谢物3848个,筛选到差异表达代谢物301个(上调207个,下调94个),其中二级鉴定差异表达代谢物9个(上调8个,下调1个)。正离子模式下二级鉴定的差异表达代谢物包括缬氨酸(valine)、苯并噻唑(benzothiazole)、3-脱羟基肉碱(3-dehydroxycarnitine)、1-甲基鸟嘌呤(1-methylguanine)、2-乙氧基萘(2-ethoxynaphthalene)、N6-乙酰基-L-赖氨酸(N6-acetyl-L-lysine)、生物素(biotin)、桑色素(morin)、噻吗洛尔(timolol)、酰基肉碱15∶0(acylcarnitine 15∶0)、酰基肉碱18∶4(acylcarnitine 18∶4)和异槲皮苷(isoquercitrin);负离子模式下二级鉴定的差异表达代谢物包括二甲基丙二酸(dimethylmalonic acid)、戊二酸(glutaric acid)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)、1,3-二乙酰基丙烷(1,3-diacetylpropane)、3-(4-羟基苯基)乳酸(DL-p-hydroxyphenyllactic acid)、泛酸(pantothenate)、荧光素(fluorescein)、飞燕草素-3-O-beta-吡喃葡萄糖苷(delphinidin-3-O-beta-glucopyranoside)和溶血磷酯酰肌醇16∶1(lysoPI 16∶1)。【结论】健康与患柞蚕微粒子病的柞蚕雌成虫血淋巴内代谢物具有显著差异,通过代谢组学挖掘出21个二级鉴定的差异表达代谢物,这些代谢物可作为潜在生物标志物用于开发柞蚕微粒子病的检测方法。

抗柞蚕核型多角体病毒病免疫卵黄抗体制备和防治效果研究

柞蚕脓病是柞蚕Antheraea pernyi养殖面临的主要病害之一。卵黄球蛋白作为来源丰富的多克隆抗体,提供了一种经济、安全、高效的动物疾病防治手段。本研究使用柞蚕脓病病原柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)免疫产蛋母鸡,制备抗ApNPV免疫卵黄抗体(IgY),并测定了IgY对柞蚕的安全性;随后饲喂试验确定了IgY的最佳稀释倍数;探索添食IgY对柞蚕脓病的预防和治疗效果。结果显示:(1)免疫抗原后6~8周收集的IgY具有最高效价,达到1∶210;(2)安全性试验未发现不良影响,且IgY最佳稀释倍数为64倍;(3)同时饲喂IgY和病毒处理的叶片时,柞蚕脓病发病率显著降低,对柞蚕脓病抑制效果最佳;先饲喂病毒叶后给予IgY叶也有一定的效果。研究结果表明,抗ApNPV IgY对柞蚕脓病具有防治作用,为柞蚕脓病的防治探索了一条新途径。

柞蚕蛹期灵菌败血病Serratia marcescens C3菌株分离鉴定

以柞蚕(Antheraea pernyi)蛹为替代寄主繁殖白蛾周氏啮小蜂(Chouioia cunea)技术在辽宁、北京、天津、上海、河北、山东等地美国白蛾(Hyphantria cunea)的生物防治中发挥了重要作用。利用柞蚕蛹繁殖白蛾周氏啮小蜂时,柞蚕蛹期软化病是繁蜂的主要障碍。通过对利用柞蚕蛹繁蜂时蛹内组织液化后呈粉红色这一未知软化病的典型症状进行病原细菌的分离和纯化,得到C3菌株。经Biolog系统和16S rRNA序列分析,鉴定C3菌株为灵菌(Serratia marcescens),经过柯赫法则检验,确定灵菌C3菌株是导致柞蚕蛹期灵菌败血病的病原菌。描述了繁蜂时柞蚕蛹期灵菌败血病发病期的认别特征。