6种活性化合物对旋毛虫各期虫体的体外杀伤作用

为了筛选有效活性化合物对旋毛虫不同发育时期虫体的体外杀伤作用,采用体外培养的方式测定三氯生等6种活性化合物对旋毛虫的体外杀伤效果,用倒置显微镜观察旋毛虫形态并计数。结果显示,三氯生对旋毛虫肌幼虫、成虫、新生幼虫均有明显杀伤作用(P<0.01),没食子酸辛酯对旋毛虫成虫和新生幼虫有明显杀伤作用(P<0.01),吡咯-2-羧酸、邻羟基苯乙酸、亚精胺盐酸盐、1,5-戊二胺仅对旋毛虫新生幼虫有杀伤作用(P<0.05)。亚精胺盐酸盐在高浓度下对肌幼虫有杀伤作用但效果不佳。结果表明,这6种活性化合物对旋毛虫各时期有虽有不同程度的杀伤作用,但只有三氯生对旋毛虫3个时期均具有明显的杀伤效果,该筛选结果为进一步开展体内试验研究提供了依据。

抗旋毛虫鸡卵黄抗体的活性检测

目的制备特异性抗旋毛虫的鸡卵黄免疫球蛋白,研究其免疫应答规律及其稳定性。方法用纯化的旋毛虫幼虫免疫育龄种鸡,经水稀释法初步纯化浓缩后获得卵黄抗体。应用酶联免疫吸附试验检测卵黄抗体的效价及其敏感性和稳定性。结果通过免疫可成功诱导出高效价的抗旋毛虫抗体,效价可达1∶106以上,免疫应答持续时间可达34周以上。免疫后卵黄抗体敏感性和血清抗体敏感性无显著性差异(P>0.05)。稳定性试验表明IgY敏感性高,在pH4～10及温度不超过60℃条件下活性稳定。结论成功制备出高效价的特异性抗旋毛虫卵黄抗体,其敏感性高,有一定的耐热、耐酸碱性,可进一步用于旋毛虫感染的研究。

旋毛虫脱氧核糖核酸酶-Ⅱ酶活及酶活性位点的鉴定

以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶-Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH 8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸(H),而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。

旋毛虫抗肿瘤机制研究进展

旋毛虫具有抗多种肿瘤的作用,宿主感染的旋毛虫数量不同,其体内肿瘤受抑制程度亦不同;宿主在感染旋毛虫后的不同时间接种肿瘤细胞,体内肿瘤的生长速度降低程度也不同。旋毛虫在宿主体内发育的不同阶段,均可能具有抗肿瘤作用。旋毛虫通过细胞免疫、肿瘤抗原和抗肿瘤活性物质发挥抗肿瘤作用。

感染旋毛虫小鼠免疫功能变化的动态观察

本文对感染旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性，脾ＮＫ细胞杀伤活性和白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２）产生能力进行了动态检测。小鼠在感染旋毛虫后１～５周，上述三项指标均降低，与正常对照组差异非常显著（Ｐ＜０．０１），提示旋毛虫感染对宿主非特异性免疫及特异性免疫功能均产生非常明显的抑制作用，其中ＩＬ－２产生能力与ＮＫ活性的变化较一致，感染后第４周比第１周的免疫抑制更强（Ｐ＜０．０１）。

有机溶剂胁迫下苦草生理指标的变化

该文研究实验培养的沉水植物苦草分别暴露于1mL有机溶剂乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和石油醚下的生长状况,并测定了植物叶片的叶绿素含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等生理生化指标.分析结果表明,五种有机溶剂对苦草生长和生理过程均可产生胁迫作用,其中乙醇、二甲基甲酰胺、丙酮影响大,短期内可以造成植物叶片变黄或变黑,叶绿素和可溶性蛋白含量急剧下降,石油醚次之,二甲亚砜影响最小.在有机溶剂胁迫下,苦草自身的防御酶系统可产生相应抗性,从抗氧化酶的活性大小来看,丙酮处理样最高,乙醇处理样最低.研究结果表明,有机溶剂对苦草的作用与有机溶剂的种类以及性质有一紧密联系.

旋毛虫肌幼虫活性鉴别的探讨

目的通过调节温度鉴别旋毛虫肌幼虫的活性。方法人工消化法收集纯净的肌幼虫,将肌幼虫分别置于3种温度下,观察肌幼虫的形态特点。结果 4℃时,活肌幼虫虫体蜷曲呈螺旋状,活动力弱;37℃时,活肌幼虫虫体呈屈曲样运动,运动活泼;将肌幼虫置100℃温度时,幼虫致死,幼虫虫体呈C字形或虫体内部结构崩解。结论旋毛虫肌幼虫的活虫在4℃时虫体蜷曲,37℃时虫体运动活泼;死亡虫体呈C字形或虫体内部结构崩解。

白族药倒钩刺化学成分及其抗旋毛虫活性研究

目的:研究白族药倒钩刺的化学成分及其抗旋毛虫活性。方法:采用反复硅胶柱色谱以及MCI、D101型大孔树脂、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶等多种色谱手段对倒钩刺干燥全株95%乙醇提取物进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用体内感染旋毛虫小鼠模型探讨倒钩刺的抗旋毛虫活性。结果:从倒钩刺中分离纯化得到20个化合物,分别鉴定为:蔷薇酸(1)、(-)-表儿茶素(2)、(+)-儿茶素(3)、柚皮素(4)、二氢槲皮素(5)、槲皮素(6)、山柰酚(7)、salsolol A(8)、artonin ZA(9)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)、山柰酚香豆酰基吡喃葡萄糖苷(11)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(12)、7-甲氧基香豆素(13)、4-羟基苯甲醛(14)、对羟基苯乙酮(15)、香草酸(16)、β-谷甾醇(17)、12-hydroxybakuchiol(18)、琥珀酸(19)、3,3′-二甲氧基鞣花酸(20)。活性研究结果显示,倒钩刺有一定的抗旋毛虫活性,95%乙醇提取物(200 mg/kg)活性显著,平均减虫率可达63.7%±9.2%。结论:除化合物1、7、10外,其他均为首次从该植物中分离得到,化合物5、8、9、13~15、18~20为首次从悬钩子属植物中分离得到。倒钩刺具有一定的抗旋毛虫活性。

旋毛虫重组热休克蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞的活化研究

目的观察旋毛虫70 ku重组热休克蛋白(rTs-Hsp70)对体外培养的小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)的活化作用。方法分离BMDC,体外培养至第6 d,培养基中加入rTs-Hsp70刺激培养24 h,ELISA检测培养上清中细胞因子IL-12P70和TNF-α的含量,流式细胞仪检测BMDC表面标志分子CD11c和CD86的表达,同时观察细胞的形态。实验平行设立不加刺激物的阴性对照组,细菌脂蛋白LPS阳性对照组和煮沸变性的rTs-Hsp70组。结果 rTs-Hsp70刺激组DC培养上清中的IL-12P70和TNF-α水平与不加刺激物对照比较差异有统计学意义(P<0.05);CD86+双阳性细胞的百分比为27.0%;电镜观察rTs-Hsp70刺激后的DC呈成熟细胞形态,相邻细胞间的突起形成连接。结论 rTs-Hsp70可能通过诱导DC的成熟而使其活化,从而激活小鼠产生抗旋毛虫感染的免疫保护作用。

重组旋毛虫plancitoxin-1-like活性位点突变体蛋白的核酸酶活性

旋毛虫plancitoxin-1-like(Ts-Pt)是旋毛虫125种DNaseⅡ家族蛋白中唯一具有典型DNaseⅡ活性区域HKD基序的核酸酶,且普遍认为,组氨酸位点是DNaseⅡ的活性氨基酸位点。为研究Ts-Pt活性位点突变体蛋白的核酸酶活性,利用重叠PCR方法获得Ts-Pt活性位点突变体片段,以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。重组Ts-Pt突变体蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用琼脂糖凝胶电泳法和核酸酶酶谱分析重组Ts-Pt突变体蛋白的核酸酶活性。成功构建含Ts-Pt突变体重组质粒的基因工程菌,SDS-PAGE和亲和层析纯化结果显示,重组Ts-Pt突变体蛋白呈包涵体表达。重组蛋白经复性后并没有表现出核酸酶活性,但核酸酶酶谱分析结果显示,包涵体表达的重组Ts-Pt突变体蛋白表现出降解DNA的能力。同时,N端和C端活性位点H及HCK和DHSK突变并不影响Ts-Pt的核酸酶活性,研究结果为进一步研究庞大的DNaseⅡ家族蛋白在旋毛虫发育和感染方面的作用提供一定的参考。

旋毛虫谷氨酸脱羧酶基因的原核表达及其活性研究

采用RT-PCR从旋毛虫中扩增出谷氨酸脱羧酶(TsGAD)基因全长,将其克隆到表达载体pET-30a(+)后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,应用比色法鉴定表达产物(rTsGAD)的酶活性,并用纯化的GAD蛋白制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-TsGAD,经SDS-PAGE分析,rTsGAD蛋白的分子质量约为57ku。利用比色法测得粗提的rTsGAD具有酶活性,酶活力为1.5U。制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶65 536。Western-blot分析结果显示,该多克隆抗体与TsGAD具有较强的反应性。结果表明,本试验成功原核表达了rTsGAD,并制备了多克隆抗体,为TsGAD定位以及进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。

旋毛虫幼虫体外对肠上皮细胞侵入及发育的观察

目的观察旋毛虫幼虫在体外对肠上皮细胞的侵入及发育情况。方法将旋毛虫肌幼虫在大鼠肠内容物或小鼠胆汁中孵育2 h后,分别接种至半固体培养基（DMEM/F12完全培养基＋1.75%琼脂糖）、半固体培养基＋T84细胞、DMEM/F12完全培养基＋T84细胞及半固体培养基（高糖DMEM完全培养基＋1.75%琼脂糖）＋Caco-2细胞中,37℃5%CO2培养24 h,观察并计数细胞层中的1期及2~4期幼虫。结果经肠内容物与胆汁孵育后的幼虫在半固体培养基＋Caco-2细胞中发育为2~4期幼虫的百分比分别为50.00%和34.78%（χ2=0.836,P〉0.05）,两者均高于经RPMI-1640孵育的幼虫百分比8.70%（χ21=5.978,χ22=4.600,P〈0.05）。经肠内容物孵育后的幼虫在半固体培养基＋T84细胞中2~4期幼虫的百分比（40.00%）显著高于半固体培养基中的幼虫百分比4.76%（χ2=10.947,P〈0.05）;在T84和Caco-2细胞中发育为2~4期幼虫的百分比分别为40.00%和50.00%,差异无统计学意义（χ2=0.546,P〉0.05）;在完全培养基＋T84细胞中未观察到2~4期幼虫;在半固体培养基中,幼虫可侵入T84/Caco-2细胞并在细胞单层中移行,留下明显的移行轨迹,培养37 h与42 h后分别发现1条雌虫与3条雄虫。结论旋毛虫幼虫经肠内容物或胆汁孵育后再接种至半固体培养基,可在体外侵入肠上皮细胞并能生长发育。

旋毛虫醛缩酶基因的克隆表达及重组蛋白酶比活性的分析

根据旋毛虫醛缩酶(aldolase,ALD)基因序列设计1对特异性引物,以肌幼虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增肌幼虫的ALD基因。将该基因克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,再将该基因亚克隆到pET-32a(+)载体中,测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后用SDS-PAGE进行分析。结果显示,该基因与GenBank中旋毛虫醛缩酶基因的相似性高达99%。该基因在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白大小约为57ku,重组蛋白在菌体上清和沉淀中均有存在。Western-blot分析显示,重组蛋白可被人工感染旋毛虫的大鼠血清所识别。通过3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法测定该重组酶的比活性,发现该重组蛋白的最佳反应温度和pH值分别为35℃和7.0。结果表明,该重组蛋白具有一定的抗原性和酶比活性。