低温乙醇法纯化抗人T细胞猪免疫球蛋白的研究

用健康人T淋巴细胞免疫猪,检测指标合格后采集猪血浆,经热吸收去除相应的杂抗体后,用改进的低温乙醇法分离纯化得到抗人T细胞猪免疫球蛋白。试生产5批,其主要质量指标均符合《中国药典》的要求,表明改良的低温乙醇法可用于纯化抗人T细胞猪免疫球蛋白。

传代人淋巴细胞免疫猪的免疫效果初探

目的用传代人淋巴细胞替代人T淋巴细胞进行猪的免疫,用于试制抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG)免疫猪血浆,并评价其免疫效果。方法大量培养传代人淋巴细胞至免疫所需浓度及数量,采用常规猪免疫程序进行2次基础免疫及1次加强免疫,获得免疫猪血浆,用E玫瑰花环形成抑制试验和淋巴细胞毒试验进行效价检测。结果3批免疫猪血浆的E玫瑰花环形成抑制试验结果均达到1∶1000(花环形成率均小于对照组平均花环形成率的75%),淋巴细胞毒试验结果均达到1∶500(淋巴细胞死亡率均大于20%),效价均达到《中华人民共和国药典》2015版(三部)中生产用免疫猪血浆的效价标准。结论传代人淋巴细胞可作为人T淋巴细胞的替代免疫原进行猪的免疫,获得了效价合格的免疫猪血浆,用于P-ATG的制备。

抗人T淋巴细胞猪免疫球蛋白对小鼠再生障碍性贫血的影响

目的探讨抗人T淋巴细胞猪Ig对再生障碍性贫血小鼠骨髓象及骨髓粒系、红系和巨核系的影响。方法 ICR小鼠60只,雄性,3～4周龄;体质量16～18g;随机分为A组(1000mg·kg-1受试品)、B组(500mg·kg-1受试品)、C组(250mg·kg-1受试品)、D组(1000mg·kg-1阳性对照组)、E组(模型组)、F组(9g.L-1盐水组),每组10只。小鼠皮下注射2.5g.L-1苯玉米油溶液复制再生障碍性贫血模型,骨髓涂片Wright染色,光镜大体观察;油镜下进行骨髓涂片分类计数、骨髓细胞混悬液有核细胞计数。结果 1000mg·kg-1受试品组骨髓片有核细胞多数呈增生活跃状态,部分呈增生减低趋势;500mg·kg-1受试品组骨髓片有核细胞增生减低;250mg·kg-1受试品组骨髓片有核细胞增生明显减低,骨髓小粒造血细胞减少;模型组骨髓片有核细胞增生极度减低,骨髓小粒造血细胞明显减少,但500mg·kg-1、250mg·kg-1受试品组和模型组的淋巴细胞数量较9g.L-1盐水组稍增多,纤维细胞等非造血细胞增加;1000mg·kg-1阳性对照组结果与1000mg·kg-1受试品组结果相同。骨髓有核细胞计数显示,与模型组比较,高、中剂量的受试品组及阳性对照组骨髓有核细胞数明显增加。结论抗人T淋巴细胞猪Ig可明显改善再生障碍性贫血动物的骨髓象。

盐析法与低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白工艺的对比

目的两种常用抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin)制备工艺的对比。方法以人T淋巴细胞免疫的健康猪血浆为原料,采用硫酸铵-Sephadex A-50和Cohn低温乙醇法,经醛化人健康红细胞、醛化人胎盘渣及混合人血浆吸收后,制备抗人T细胞猪免疫球蛋白,参考《中国药典》三部(2010版)相关附录,进行中间品及成品检定。结果用硫酸铵盐析法与低温乙醇法连续分别制备了3批产品,每批投浆量约5 000 ml;3批中间品鉴别试验及3批成品检定结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求,两种工艺方法均适用于制备抗人T细胞猪免疫球蛋白,但在质量和收获率上,低温乙醇法更具优势。结论低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白更适用于生产。

抗人T细胞猪免疫球蛋白的有效期研究

目的研究低温乙醇法工艺生产的抗人T细胞猪免疫球蛋白的有效期。方法将3批经全面检定合格的抗人T细胞猪免疫球蛋白置（6±2）℃贮存36个月,分别于0、3、6、9、12、18、24、30、36个月取样,参考《中国药典》三部（2005版）中抗人T细胞猪免疫球蛋白检测方法和标准,对制品外观、pH值、纯度、蛋白含量、分子大小分布以及效价进行检定。将E玫瑰花环形成抑制试验及淋巴细胞毒试验的标示量与贮存时间结果导入Excel,使用6SQ统计加载项,进行一元线性回归,选择时间和预测区间的上或下限作散点图,在散点图中选择添加趋势线,如可观察到预测区间的上限值呈线性,可在趋势预测/回归分析类型中选择线性,获得拟合方程,将标示量带入方程中,计算获得有效期。结果根据E玫瑰花环形成抑制试验效价测定结果,理论推算在（6±2）℃条件下保存时,有效期可达41～100个月;根据淋巴细胞毒试验效价测定结果,理论推算在（6±2）℃条件下保存时,有效期可达47.9～64.3个月。结论初步确定抗人T细胞猪免疫球蛋白制品有效期为30个月。

抗人T淋巴细胞猪免疫球蛋白中戊二醛残留量的检测

目的建立高效液相色谱测定抗人T淋巴细胞猪免疫球蛋白中戊二醛残留量的方法。方法取供试品,与2,4-二硝基苯肼柱前衍生化,过滤,进样。色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶填充柱;以50%乙腈(乙腈∶水=1∶1)溶液为流动相,流速为0.9 ml/min,检测波长为360 nm,柱温30℃。用该方法检测2批供试品中戊二醛的含量,并确定该方法的检测限、定限量、准确度和精密度。结果该方法检测的2批供试品中戊二醛的含量分别为9.8和7.5μg/ml;该方法的检测限为0.61μg/ml,定量限为2.04μg/ml,在2～20μg/ml范围内,其线性相关系数为0.998 2,检测5、10、15μg/ml戊二醛的回收率分别为102.3%、101.6%和99.2%,相对标准偏差均小于4.0%。结论高效液相色谱法可以简便、准确地检测抗人T淋巴细胞猪免疫球蛋白中戊二醛的残留量,为其生产工艺参数的确定提供了实验依据。

低温乙醇法与硫酸铵盐析法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白的质量对比研究

目的采用低温乙醇法试制抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human Tlymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG),并对最终制品与原硫酸铵盐析法工艺制品进行质量对比研究,评价其质量特性。方法采用《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015版(三部)中关于P-ATG的制品质量标准及扩展质量研究对商业化规模3批原硫酸铵盐析法及3批低温乙醇法P-ATG制品进行质量对比研究。结果3批低温乙醇法制品与硫酸铵盐析法制品均达到《中国药典》2015版(三部)中制品质量标准;扩展研究中,2种工艺制品的远紫外CD均值为93.43%,近紫外CD均值为97.68%,远紫外/近紫外CD相似度CV值均<0.5%;热稳定性结果显示,2种工艺制品的T_(m)值除T_(m2)外(P=0.031),差异均无统计学意义(P>0.05)。表明低温乙醇法工艺稳定性良好,批间差异较小,与硫酸铵盐析法具有良好的可比性。结论采用低温乙醇法可获得品质良好的P-ATG制品,可作为P-ATG的生产工艺。

两种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白原料和成品中淋巴细胞毒效价检测方法的相关性分析

目的建立一种简易的流式细胞术检测猪抗人T淋巴细胞免疫球蛋白原料和成品中的淋巴细胞毒效价,并分析其与《中国药典》方法的相关性。方法用《中国药典》方法中的淋巴细胞毒试验检测500倍和1000倍稀释的人外周血免疫的猪血浆,在《中国药典》方法的基础上将用0.5%的台盼蓝染色镜检改为用5μg/mL的PI溶液进行流式细胞术分析;用两种方法检测不同稀释倍数的猪抗人T淋巴细胞免疫球蛋白成品;用相同的评判标准对两种方法检测猪血浆和免疫球蛋白成品的结果进行对比及相关性分析。结果《中国药典》方法检测500倍和1000倍稀释的免疫后猪血浆的合格率分别为52.9%和17.6%,流式细胞术检测的合格率分别为100%和94.1%;《中国药典》方法检测不同稀释倍数成品的结果低于流式细胞术,但二者结果的趋势一致;两种方法检测500倍和1000倍稀释原料的结果在95%置信区间的相关系数(r)分别为0.632和0.611,P均小于0.01,极显著相关。《中国药典》方法检测500倍和1000倍稀释原料的r为0.737,而流式细胞术为0.919。两种方法检测成品的r为0.910,P为0.0007,也极显著相关。结论建立的简易流式细胞术可更准确地应用于猪抗人T淋巴细胞免疫球蛋白原料和成品中淋巴细胞毒效价的定性检测。

低pH孵放对免疫抑制剂抗人T细胞猪免疫球蛋白病毒灭活效果的验证

目的通过对免疫抑制剂抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG)低pH孵放工艺[pH 3.8~4.2,(24±2)℃,24 d]病毒灭活效果的验证,评价动物源性多抗免疫抑制剂的安全性。方法以人源的水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SV)和猪源的伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)以及人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)作为指示病毒,检测低pH孵放工艺对这些包膜病毒的灭活效果。结果P-ATG经低pH孵放[pH 3.8~4.2,(24±2)℃,24 d]后,指示病毒VSV、SV、PRV和HIV的滴度分别下降了5.75~6.00 lgTCID_(50)/0.1 mL,6.70~6.98 lgPFU/mL,5.25~5.75 lgTCID_(50)/0.1 mL和4.20~4.40 lgTCID_(50)/mL,下降滴度均在4.0 lg以上。结论P-ATG低pH孵放工艺能有效灭活4个lg以上的包膜病毒,保证人用免疫抑制治疗制剂P-ATG的用药安全。

低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白的非临床安全性评价

目的采用低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG),并对其进行多项非临床研究,同时与原硫酸铵盐析工艺制品(市售制品)进行非临床对比研究,评价2种制品在毒理特性方面的一致性。方法给予新西兰兔的血管重复刺激性试验,评价2种制品对注射部位的局部反应;新西兰兔红细胞的体外溶血试验,评价2种制品的溶血性;单次给药静脉注射SD大鼠进行毒性试验,评价2种制品的急性毒性;4周重复给药静脉注射SD大鼠进行毒性并伴随局部刺激性、免疫原性和毒代动力学试验,评价2种制品的长期毒性。结果2种工艺制品连续5 d静脉注射新西兰兔,未见局部刺激性;2种工艺制品体外对新西兰兔红细胞无溶血作用,不引起新西兰兔红细胞凝聚;供试品组(低温乙醇法)在累计剂量1560 mg/kg和市售对照组(硫酸铵盐析法)在累计剂量1640 mg/kg的情况下,单次静脉注射SD大鼠产生的急性毒性反应相同,未显示出明显毒性,P-ATG(低温乙醇法)最大耐受量(maximum tolerance dose,MTD)>1560 mg/kg,为等效剂量的10.4倍,临床拟用剂量的62.4倍;供试品组(低温乙醇法)低、中、高剂量组分别在每日剂量195、310、780 mg/kg的情况下,重复静脉注射SD大鼠未出现明显毒性;供试品组(低温乙醇法)中剂量组在每日剂量310 mg/kg和市售对照组(硫酸铵盐析法)在每日剂量410 mg/kg的情况下,重复静脉注射SD大鼠产生的毒性特征基本一致,毒性结果变化趋势也较为接近,P-ATG(低温乙醇法)的未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)为780 mg/kg,为等效剂量的5.2倍,临床拟用剂量的31.2倍。结论低温乙醇法制品和硫酸铵盐析法制品的毒理特性具有良好的一致性。

不同免疫诱导治疗方案对活体亲属ABO血型不相容肾移植受者术后早期临床结局的影响

目的比较活体亲属ABO血型不相容肾移植(ABO-incompatible kidney transplantation,ABOi-KT)受者应用不同种类免疫诱导方案的早期(术后6个月内)临床结局。方法回顾性分析2018年6月至2022年9月在华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所行活体亲属ABOi-KT 41例受者的临床资料。其中,采用抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobin,pATG)行诱导治疗者13例(pATG组),采用白细胞介素-2受体拮抗剂者19例(巴利昔单抗组),采用兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(rabbit anti-human thymocyte immunoglobulin,rATG)诱导者9例(rATG组)。统计并分析3组受者的年龄、性别、体重指数(body mass index,BMI)、透析方式、透析时间、左右供肾、血型抗体处理次数、利妥昔单抗使用剂量、基础血型抗体效价(IgG和IgM)以及受者供体的性别和BMI等方面的差异。单因素方差分析比较3组受者预处理前和移植术后6个月内的淋巴细胞计数评估受者免疫状态;单因素方差分析比较3组受者移植术后6个月内的血清肌酐、估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、血清尿素氮水平评估移植肾功能。比较3组受者术后移植肾功能延迟恢复(delayed graft function,DGF)、术后6个月内急性排斥反应(acute rejection,AR)和感染的发生情况。结果基线资料方面,除pATG组供者年龄[(60.23±6.10)岁]较巴利昔单抗组[(51.95±6.97)岁]大,差异有统计学意义(P=0.002)外,3组其余参数比较,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。pATG组受者术后第1、3、7、10、14天淋巴细胞计数分别为(0.17±0.07)×10^(9)/L、(0.27±0.14)×10^(9)/L、(0.85±0.40)×10^(9)/L、(1.05±0.56)×10^(9)/L、(1.10±0.56)×10^(9)/L,rATG组分别为(0.69±0.04)×10^(9)/L、(0.18±0.21)×10^(9)/L、(0.57±0.44)×10^(9)/L、(0.67±0.45)×10^(9)/L、(0.81±0.46)×10^(9)/L,均较巴利昔单抗组[(0.46±0.18)×10^(9)/L、(0.67±0.26)×10^(9)/L、(1.29±0.48)×10^(9)/L、(1.56±0.49)×10^(9)/L、(1.75±0.53)×10^(9)/L]低,差异均有统计学意义(P值均<0.05);在预处理前和术后21 d后3组淋巴细胞绝对计数比较差异无统计学意义(P值均>0.05)。在移植术后第1周、第2周、1个月、3个月及6个月的血清肌酐和血清尿素氮水平的差异无统计学意义(P>0.05);rATG组术后1个月、3个月时的eGFR分别为(47.24±14.51)ml·min^(-1)·(1.73 m^(2))^(-1)和(49.94±14.31)ml·min^(-1)·(1.73 m^(2))^(-1),较巴利昔单抗组(67.36±21.60)ml·min^(-1)·(1.73 m^(2))^(-1)和(65.00±14.67)ml·min^(-1)·(1.73 m^(2))^(-1)低,差异有统计学意义(P<0.05);但3组术后1周、2周及6个月时的eGFR水平差异无统计学意义(P>0.05)。3组术后1周内DGF均发生1例;术后6个月内,pATG组、巴利昔单抗组、rATG组分别发生AR 2例、2例和1例,分别发生感染4例、7例和3例。结论单中心有限的样本观察发现,对于使用pATG、巴利昔单抗和rATG进行免疫诱导治疗的ABOi-KT受者,移植术后早期的DGF差异无统计学意义。3组均有DGF、AR和感染发生,但组间差异不大。