大口黑鲈amh基因全长cDNA克隆、表达及多克隆抗体制备

为研究大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗缪勒氏管激素(amh)基因的表达及其在性腺发育中的潜在作用,研究利用RACE技术克隆得到了大口黑鲈amh基因,并制备Amh多克隆抗体,通过qRT-PCR、Western Blot分析Amh在大口黑鲈不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式,最后利用HE染色法和免疫组化观察不同发育阶段性腺的形态组织学变化及其与Amh表达的潜在关系。结果显示:大口黑鲈amh基因cDNA序列全长2050 bp,由24 bp5′非编码区、394 bp3′非编码区和1632 bp的开放阅读框组成,共编码543个氨基酸。amh基因mRNA在大口黑鲈11个组织中均有表达,其中雄鱼精巢中表达量最高,肌肉次之,雌鱼卵巢中表达量最高,肌肉次之。amh基因在雌雄鱼不同发育阶段的性腺中表达存在显著差异,精巢中表达量均显著高于卵巢(P<0.05)。同时,Western Blot结果显示Amh蛋白在精巢中表达丰度较高。amh基因在精巢中的表达量呈先上升后下降的趋势,且在孵化后65d鱼精巢中其表达量达到最高(P<0.05),免疫组化结果显示Amh表达于早期精巢的支持细胞;孵化后135d和215d雄鱼精巢中其表达量明显下降,HE染色显示雄鱼精巢处于精子细胞生成和精子形变期,Amh主要表达于支持细胞中,精子占据精巢的绝大部分空间,支持细胞所占面积比例减少。amh基因在孵化后45d、65d和135d雌鱼卵巢中表达量较低,孵化后215d表达量上升,并且在卵母细胞的细胞膜边缘及外周的滤泡细胞和颗粒细胞检测到了Amh阳性信号。研究结果表明:在精巢中,Amh可能参与早期精巢发育;在卵巢中,其可能参与颗粒细胞和滤泡细胞发育。综上所述,Amh在大口黑鲈性腺发育中发挥着关键的调控作用。

复发性流产影响因素分析及预测模型的构建

目的:基于复发性流产影响因素构建预测模型并评估其效能。方法:选取复发性流产患者和同期入院体检的已生育健康女性各80例,分别作为观察组和对照组。比较2组自身免疫性抗体[抗精子抗体(ASAb)、抗子宫内膜抗体(AEMAb),抗心磷脂抗体(ACAb)及抗卵巢抗体(AOAb)]、抗苗勒氏管激素(AMH)水平及男性伴侣中精浆生化三项差异;采用多因素Logistic回归构建预测模型,并绘制受试者工作特征(ROC)曲线评价其预测能力。结果:观察组女性血清ASAb、AEMAb、ACAb、AOAb水平高于对照组,而AMH水平低于对照组;观察组男性伴侣中果糖、精浆锌、α葡萄糖苷酶较对照组低(P<0.05);多因素Logistic回归结果显示,血清ASAb、AEMAb、ACAb、AOAb、AMH水平及果糖、精浆锌、α葡萄糖苷酶均是复发性流产发生的影响因素(OR=3.476、3.180、3.364、3.203、2.651、2.617、2.596、2.633,P<0.05);ROC曲线分析显示,自身免疫性抗体、AMH及精浆生化指标联合预测模型预测复发性流产的曲线下面积(0.985)最高,灵敏度、特异度分别为96.25%和91.25%。结论:自身免疫性抗体、AMH及果糖、精浆锌、α葡萄糖苷酶是复发性流产的影响因素,基于其构建的预测模型,对复发性流产具有较高的预测效能。

抗苗勒管激素免疫磁珠的制备及其初步应用

目的制备人的抗苗勒管激素(AMH)免疫磁珠及酶标抗体,初步建立一种基于纳米磁珠的双抗体夹心ELISA快速检测方法。方法构建人AMH重组蛋白表达载体,表达和纯化AMH重组蛋白,将获得的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。通过聚乙二醇将脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,采用ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内腹水诱生法制备抗体,结合Western blot法评价单克隆抗体。利用蛋白A(Protein A)对抗体进行亲和层析纯化,将多克隆抗体作为捕获抗体偶联至纳米级羧基聚合物磁珠,以高碘酸钠法对单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记作为抗体探针,建立并优化基于纳米磁珠的双抗体夹心ELISA。结果获得一株具有良好特异性的抗AMH单克隆抗体,其亚型为IgG2b,纯化的多克隆抗体和单克隆抗体的效价均可达1∶51200。与磁珠偶联后的捕获抗体以及酶标记后的探针抗体仍然具有较好的活性。建立的方法可在1 h左右检测出AMH抗原,检测下限在50 ng/mL左右。结论制备的AMH免疫磁珠能够用于重组AMH的检测,具有快速、可视化的优点。

针药联合治疗肾虚肝郁型卵巢功能低下60例临床研究

目的观察针药联合治疗肾虚肝郁型卵巢功能低下患者的治疗效果。方法选择2014年10月至2015年9月在荔湾区中医院诊断为肾虚肝郁型卵巢功能低下患者60例，随机分为针药组和对照组，每组30例。针药组患者给予口服补肾调肝合剂联合针灸治疗，对照组给予口服补。肾调肝合剂，两组均以3个月为1个疗程，观察2个疗程后两组患者取得的疗效。结果治疗后两组患者的全身症状、症状积分均明显改善，两组患者血清卵泡刺激素（FSH）、血清雌二醇（E2）水平明显下降（P〈0．05）、抗苗勒氏管激素（AMH）水平明显升高（P〈0．05）；且针药组的有效率、妊娠率、疗程及血清FSH、AMH改善情况明显优于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论补肾调肝合剂联合针灸能缩短疗程，明显减轻卵巢功能低下患者的身心痛苦，降低了血清卵泡刺激素水平，提高卵巢储备功能及临床妊娠率。