基于重组人Ⅲ型胶原蛋白的三聚体抗原疫苗策略在新冠和流感疫苗中的应用

新冠病毒等多种包膜病毒的糖蛋白在天然状态下呈现三聚体形式。三聚体蛋白通常较单体蛋白具有更优的免疫原性。目前使用非人蛋白来源的Foldon等三聚体基序可促使目的蛋白形成稳定三聚体,但这些基序的强免疫原性会削弱目的蛋白的免疫应答,限制了其在疫苗抗原设计中的应用。在本研究中,发现并利用重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(Rh3C)作为新型三聚体基序,利用合成生物学方法,与新冠病毒刺头(spike)蛋白受体结合域(RBD)融合表达后促使RBD形成三聚体。这种胶原-RBD(Rh3C-RBD)三聚体蛋白在免疫小鼠后,较RBD单体蛋白诱导产生了更高滴度的结合抗体和中和抗体。此外,我们还进一步验证了该Rh3C基序与流感病毒HA1蛋白融合后,较HA1单体蛋白可在小鼠体内诱导更强效的抗体应答。因此,这种新型的Rh3C基序,有望广泛用于三聚体疫苗抗原的设计和优化。

半抗原的设计、修饰及人工抗原的制备

制备具有良好免疫原性的人工抗原是建立测定小分子化合物的免疫分析方法的最关键步骤。本文对半抗原的设计、修饰(修饰位点的选择、修饰物的制备、连接臂的选择)、载体的选择、半抗原与载体的偶联(偶联方式、偶联条件、最佳偶联率)、人工抗原的纯化与鉴定等方面作了详细的介绍。

农药人工抗原的合成研究进展

免疫分析法是以抗原、抗体的特异性识别和可逆性结合反应为基础,以抗体作为生物检测器而建立的一种灵敏、简便、快速的超微量分析方法。抗原的质量决定了抗体的特异性和亲和性,最终影响免疫分析的质量。在农药残留的分析中,建立免疫分析方法的关键是农药人工抗原的合成,包括半抗原的设计(强调连接臂的位置、长度、性质和功能基团的引入)、半抗原的合成、载体的选择、半抗原与载体的偶联方法和条件、最佳结合比的讨论、人工抗原的纯化与鉴定。

农药人工抗原合成方法的设计与优选

农药人工抗原的合成直接影响后期制备抗体的质量,对于建立农药分子特异、灵敏的免疫分析方法具有关键性作用。综述了国内外农药人工抗原合成过程中的农药分子半抗原的设计原则、合成方法,人工抗原的设计、优选及影响因素等方面的研究进展。并对农药残留免疫分析技术存在的问题和应用前景进行了讨论。

B族黄曲霉毒素抗原合成设计及特异性、广谱性抗体制备与特性分析

为制备B族黄曲霉毒素(BGAFs)特异性强、广谱性好的抗体,本研究根据黄曲霉毒素B1(AFB1)的分子结构和活性位点,采用肟化活泼酯法(OAE)、氨甲基化法(MOA)、混合酸酐法(MA)、半缩醛法(SA)、环氧化物法(EP)和烯醇醚衍生物法(EED)6种方法合成BGAFs人工抗原AFB1-BSA,并通过UV和SDS-PAGE进行鉴定;采用AFB1-BSA免疫新西兰白兔制备多克隆抗体(AFB1 pAb),间接ELISA检测AFB1 pAb效价,间接竞争ELISA(icELISA)分析其敏感性,交叉反应试验(CR)分析其特异性和广谱性。结果表明,AFB1-BSA合成成功,在BGAFs抗原合成的6种方法中OAE效果最好,AFB1与BSA的分子结合比为8.46∶1;AFB1 pAb的间接ELISA效价为1∶(1.28×104),IC50为10.32μg·L-1,与AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2的CR分别为75.21%、44.13%、14.72%、16.36%、1.44%。本研究制备出了高效价、敏感、特异、广谱的AFB1 pAb,为BGAFs免疫检测方法的建立奠定了物质和技术基础。

HBcAg病毒样颗粒与疫苗设计

寻找有效的疫苗来治疗肿瘤和微生物感染性疾病一直是人们追求的目标。近年来,基于乙型肝炎病毒核心抗原的颗粒疫苗在该领域取得了一些新的进展。本文就这些新的进展作一综述。

恩拉霉素人工抗原合成工艺的优化

为制备恩拉霉素(Enramycin)抗体及建立恩拉霉素残留检测方法提供参考,采用L9(34)正交试验设计优化恩拉霉素-牛血清白蛋白人工免疫抗原(Er-BSA)的合成工艺条件,通过紫外光谱对合成效果进行鉴定。结果表明:最佳合成反应条件为反应物质量比(mBSA∶mER)为1∶1,反应溶剂比(VPBS∶V二氧六环)为2∶1,pH 6.7和反应温度28℃,其合成物的偶联率为25.70。反应物质量比和反应温度是影响反应的主要因素。

可溶性重组日本血吸虫26 kDa GST的优化表达

目的探讨在大肠杆菌中表达可溶性重组日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶(rSj26 GST)的优化条件。方法用含有Sj26基因的原核表达载体pGEX-3X转化大肠杆菌BL21(DE3),将影响可溶性rSj26 GST表达的4个因素,即温度、诱导剂IPTG浓度、诱导时细菌的密度和诱导时间进行正交设计,确定其优化表达条件并大量表达,采用谷胱甘肽亲和层析法纯化表达的蛋白,测定酶活性,通过Western blot鉴定免疫活性。结果正交设计的直观分析和方差分析结果显示:可溶性rSj26GST最佳表达条件为温度25℃,IPTG的浓度1 mmol/L,诱导前细菌的生长密度0.9,诱导表达时间8 h。可溶性rSj26 GST纯化的产量为16 mg/L,Western blot证实rSj26 GST具有良好免疫原性和免疫反应性。结论通过正交设计确定了可溶性rSj26 GST在大肠杆菌中表达的优化条件。

乙肝病毒新型免疫原性多肽的设计、合成

在乙肝病毒高分辨率免疫识别的基础上，以Ｐｒｅ－Ｓ２蛋白的优势Ｂ细胞表位Ｂ１、Ｂ２为基础，引入不同的Ｔｈ细胞表位Ｔｈ１、Ｔｈ２，结构参照ＭＡＰ设计，采用固相合成法，合成了ＭＡＰ１和ＭＡＰ２。产物经毛细管电泳分析和氨基酸组分鉴定。

农药小分子半抗原合成的研究与应用

在农药残留免疫分析中,农药小分子半抗原的分子设计及合成是基础和关键。本文对近年来国内外关于农药小分子半抗原的设计及合成、合成的影响因素、半抗原与载体蛋白偶联方法的研究现状及应用作一综述。

用正交设计法对氯溴异氰尿酸破坏轮状病毒抗原性影响因素的研究

正交试验表明，对氯溴异氰尿酸破坏轮状病毒抗原性效果的影响，以消毒剂浓度（Ａ）为最明显，温度（Ｃ）次之，时间因素（Ｂ）较小。浓度与温度或作用时间交互作用的影响均次于消毒剂浓度单因子，３因素的最优组合为Ａ２Ｂ０Ｃ１。

拟态弧菌OmpU抗原表位的预测与多表位疫苗分子的设计

以拟态弧菌安徽分离株OmpU基因序列为基础,应用DNAStar Protean软件联合采用多种方法对OmpU的二级结构、柔性、亲水性、表面可能性和抗原指数等方面进行分析,预测OmpU的抗原表位,并以此设计多表位疫苗分子序列。结果表明,拟态弧菌OmpU至少含有9个B细胞表位,其中第24～31、56～66、93～111、123～129、183～198、253～258和275～287共7个区段的平均抗原指数较高。使用AAY接头以epitope5-epitope7-epitope2-epitope6-epitope3-epitope4-epitope1排列方式串联的多表位序列最接近原蛋白构象,各表位间相对独立,抗原性参数也较好,可作为研制多表位疫苗的候选分子序列。

含preS2免疫表位的HBsAg基因质粒的构建及表达

目的 :应用表位设计构建高效表达乙型肝炎表面抗原含preS2免疫表位基因的真核表达质粒。方法 :PCR法从慢性乙型肝炎患者血清中扩增和分离preS2 12 0 - 146表位和S基因片段 ,将两者融合并置于载体pcDNA3 1的巨细胞病 (CMV)启动子作用之下 ,构建真核表达质粒pcDNA -S2S。序列分析和脂质体转染COS - 7细胞瞬时表达鉴定。结果 :序列测定结果表明插入序列与乙型肝炎病毒中国株全基因参照序列 (adr亚型 )一致。COS - 7细胞瞬时表达鉴定实验中 ,ELISA检测到preS2 -Ag和HBsAg的OD450 分别为 0 4 6 9和 0 4 2 6。结论 :应用表位设计成功地构建了含preS2免疫表位基因的重组质粒pcDNA -S2S所构建质粒能高效表达和分泌目的的蛋白。

HBV新型免疫原的设计、合成及免疫原性研究

目的 探讨如何将表位构建成有效免疫原。方法 以Pre S( 2 ) 蛋白两优势性B细胞表位和HBcAg两Th细胞表位为基础 ,设计、合成了 2种MAP多肽 ,以此两MAP肽为免疫原免疫兔和小鼠 ,观察体液免疫反应。结果 此两种MAP多肽均比Pre S( 2 ) 蛋白诱发更高抗体滴度 ;Th细胞表位引入可显著增强反应强度。结论 增加肽抗原结构复杂性可提高其免疫原性 ,其表位排列以B细胞表位在赖氨酸核心外侧为佳 。

广谱性抗体的制备及其在食品安全快速检测中的应用进展

“民以食为天,食以安为先”,在追求效益的时代背景下,危害物的高通量高效率检测成为食品安全快速检测领域发展的新趋势。基于广谱性抗体的免疫检测法凭借其检测通量高、检测时间短、样品消耗少、总成本低等优点为多危害物同时快速检测提供了一种新思路。该文指出了广谱性抗体的3种主要制备方法及优缺点,分析了提高广谱性抗体广谱性及亲和力的常用策略,并对其在毒素类、农兽药类残留及其他常见食品危害物检测中的应用现状进行综述。该文对广谱性抗体目前存在的制备盲目性和检测灵敏性较差两大主要限制因素进行总结分析,并展望了广谱性抗体在食品安全领域的发展趋势。

三肽基肽酶Ⅱ(TPPⅡ)对抗原的提呈作用机制研究进展

三肽基肽酶Ⅱ(Ripetidyl PeptidaseⅡ,TPPⅡ)是存在于细胞质中的一种多功能丝氨酸蛋白酶,主要协助蛋白酶体和其他的胞外酶并且参与蛋白周期代谢。最近的数据显示,TPPⅡ对MHC-Ⅰ类分子抗原表位的产生与破坏均有重要作用,但是TPPⅡ在MHC-Ⅰ类抗原递呈中的具体作用机制尚有待进一步研究。本文综述TPPⅡ的细胞生物学特征,着重探究TPPⅡ在MHC-Ⅰ类抗原递呈中作用,并且指出TPPⅡ在新型疫苗设计上具有重要的指导意义。

间臂和丁基密度对疏水层析分离纯化重组乙肝病毒表面抗原的影响

以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质,合成了针对纯化中国仓鼠卵巢细胞表达乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的不同间臂(3C、8C和10C)和不同配基密度的丁基疏水介质。配基密度的增加和间臂C链的延长都会增加介质的疏水性,从而影响其对CHO-HBsAg的分离效果。采用正交实验考察了配基密度、盐浓度、pH值三个影响因素对不同间臂疏水介质性能的影响。以分离CHO表达的乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的收率和纯化倍数为主要指标。根据正交试验结果,分离效果最佳的介质间臂为8C、配基密度为22μmol/mL。该介质在硫酸铵浓度9%、pH7.0条件下,CHO-HBsAg的收率可以接近100%,纯化倍数达到60。

赭曲霉毒素A的抗原设计及在免疫分析中的应用

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一种重要的生物毒素,其广泛存在于谷物和其他植物性食品中。食品中的OTA残留进入人体后会对健康造成危害。为快速便捷地对OTA进行检测,本文以OTA为原料,设计合成了结构更加合理的新的OTA半抗原(OTA-H1),制备了OTA的完全抗原(OTA-H1-BSA,OTA-H1-OVA),并进行了小鼠免疫实验,建立了OTA间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA)。采用核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱对OTA半抗原结构进行表征,结果表明半抗原结构正确;利用OTA-H1-BSA作为免疫抗原免疫Balb/c小鼠,小鼠血清效价为8000,表明该免疫抗原对OTA具有一定的抑制作用;利用以OTA-H1-OVA作为包被抗原建立的间接竞争酶联免疫分析法检测小麦样品时,IC_(50)为0.04 ng/mL,灵敏度较原有方法提高了30倍。本方法可用于小麦样品中OTA的快速检测。

细胞治疗产品的工艺平面与厂房设施的设计

细胞治疗产品的制备分为载体物质制备和CAR-T细胞终产品制备两大部分,笔者阐述了其工艺平面,如房间布局和人流、物流等要求。重点以CAR-T细胞终产品为例,介绍了其工艺设备和厂房设施的设计要求。

精准设计疫苗

疫苗的出现极大降低了感染性疾病的发病率和死亡率,显著保障了全球公共健康。本文系统回顾了疫苗的发展史,分析归纳了各类型疫苗的优缺点,并介绍了本实验室构建的一类具有广谱保护性的新型疫苗——精准设计疫苗。精准设计疫苗是一类应用高通量技术和反向遗传学技术,定向筛选病原体全基因组内特异位点、区域,进而精准设计的重组疫苗。基于个体基因、环境、生活方式等特征的精准医学引领了新一轮的医疗变革,而这种基于病原体或异常细胞的特定基因、蛋白、通路的精准设计疫苗则为疫苗的研发提供了全新的技术和思路,将推动疫苗学进入新时代。