内生真菌Alternaria tenuissima PC-005抗耐药菌活性成分研究

目的研究内生真菌Alternaria tenuissima PC-005次生代谢产物抗耐药菌的活性成分。方法采用硅胶色谱、羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱、高效液相色谱等分离纯化手段对内生真菌PC-005次生代谢物进行分离纯化,利用MS、1H-NMR、13C-NMR等现代波谱分析技术对分离得到的单体化合物进行结构鉴定;采用96孔板法测试单体化合物对临床耐药菌的抗菌活性。结果从内生真菌PC-005次生代谢物的活性组分中分离得到7个化合物,分别为5-甲氧基格链孢酚(1)、格链孢酚(2)、对羟基苯乙酮(3)、β-谷甾醇3-O-β-D-葡萄糖苷-6'-O-棕榈酸酯(4)、β-腺苷(5)、细格菌素(6)和十八碳二烯酸(7)。化合物1、6和7对多重耐药肺炎克雷伯杆菌、普通变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、屎肠球菌和鲍曼不动杆菌有抑制作用,最低抑菌浓度为62.5~500μg·m L-1。结论化合物3~7均为从内生菌Alternaria tenuissima代谢物中首次分离。化合物1、6和7为内生真菌Alternaria tenuissima PC-005抗耐药菌的活性成分。

霍山石斛内生真菌Alternaria eichhorniae次生代谢产物研究

目的:研究霍山石斛内生真菌Alternaria eichhorniae的次生代谢产物。方法:利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20、反相制备高效液相色谱等多种色谱法分离化合物,根据波谱方法对化合物进行结构鉴定。结果:从霍山石斛内生真菌Alternaria eichhorniae中分离得到12个化合物,分别鉴定为:tricycloalternarenes 6b(1)、tricycloalternarenes 2a(2)、tricycloalternarenes 1b(3)、tricycloalternarenes 1a(4)、tricycloalternarenes H(5)、stemphyperylenol(6)、altertoxinsⅠ(7)、alterperylenol(8)、(2R,3S)-1-(4-hydroxyphenyl)butane-2,3-diol(9)、3-羟基-4-(4-羟基苯基)-2-丁酮(10)、melithasterol B(11)、(22E,24R)-3β,5α,9α-trihydroxyergosta-7,22-dien-6-one(12)。结论:所有化合物均首次从霍山石斛内生真菌Alternaria eichhorniae中分离得到。

怀山药内生真菌Alternaria sp.L12的次生代谢产物研究

目的研究怀山药内生真菌Alternaria sp.L12的次生代谢产物。方法利用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和半制备HPLC等色谱技术分离纯化Alternaria sp.L12的大米发酵产物,运用波谱分析技术鉴定化合物结构。结果从Alternaria sp.L12的大米发酵物的乙酸乙酯萃取部位中分离得到8个化合物,分别鉴定为tricycloalternarene 1b(1)、alternariol-9-O-monomethyl ether(2)、过氧麦角甾醇(3)、alternariol(4)、对羟基苯乙酸(5)、邻羟基苯乙酸(6)、苯乙酸(7)和对羟基苯乙醇(8)。结论以上8个化合物均系首次从怀山药内生链格孢属真菌的发酵物中分离得到。

亳芍内生真菌Alternaria alternate次生代谢产物的研究

目的研究亳芍内生真菌Alternariaalternate的次生代谢产物。方法利用硅胶、SephadexLH-20、反相、中压、高效液相制备等多种色谱法分离化合物,采用波谱方法对化合物进行结构鉴定。结果从内生真菌Alternaria alternate次生代谢产物中分离得到15个化合物,分别鉴定为methyl 4-acetamido-3-hydroxybenzoate(1)、(E)-methyl-5-hydroxy-3-methylpent-2-eno(2)、异苯并呋喃酮A(3)、对羟基苯乙酮(4)、6-hydroxy-isosclerone(5)、talaroflavone(6)、7-hydroxy-2-hydroxymethyl-5-methyl-4H-chromen-4-one (7)、 alternarienonicacid (8)、 7-hydroxy-2,5-dimethy-4H-1-benzopyran-4-one (9)、 5-hydroxy-epialtenuene(10)、交链孢醇(11)、methyl 3-hydroxybenzoate(12)、stemphyperylenol(13)、细格菌素(14)、交链孢烯(15)。结论其中化合物1、3、5～10、12～13为首次从内生真菌Alternaria alternate次生代谢产物中分离得到。

4株产抗肿瘤活性物质喜树内生真菌的鉴定及其主要代谢产物HPLC初步比较

采用MTT法测定了4株喜树内生真菌发酵产物的体外抗肿瘤活性,4菌株发酵产物分别对HL-60、HeLa和HepG2肿瘤细胞株增殖有一定抑制作用。通过PDA培养基上菌落、菌丝和孢子形态观察以及ITS区(包括5.8S r DNA)核酸序列分析,4株喜树内生真菌被鉴定为链格孢属(Alternaria spp.)真菌。HPLC分析显示4菌株主要代谢产物存在差异,说明植物内生真菌遗传代谢的多样性。内生真菌代谢产物是天然产物的丰富来源。

老鼠簕植物内生真菌Aspergillus terreus (W-8)抗肿瘤活性成分的研究

对红树林植物的枝干、枝叶样品进行微生物分离,以P388细胞为模型进行活性评价得到14株具有抗肿瘤活性的真菌。采用溶剂萃取、柱色谱及半制备HPLC等分离手段对来源于红树林植物老鼠簕Acanthus ilicifolius Linn.的菌株Aspergillus terreus(W-8)发酵产物进行了活性追踪分离,共得到5个化合物。通过理化性质及波谱技术,结合文献,鉴定其结构分别为aspulvinone H1(1)、aspulvinone H(2)b、utyrolactone I(3)t、errein(4)和3-propylbenzene-1,2-diol(5),其中化合物1的核磁数据为首次报道。采用MTT法初步评价了单体化合物的抗肿瘤活性,结果表明化合物4、5对A549、K562和Hela细胞均具有中等强度的细胞毒活性。

特殊生境真菌来源的新结构活性物质研究

真菌的物种与生态多样性导致了其次生代谢产物结构与活性的多样性,是药物先导化合物的重要来源之一。常规真菌来源活性物质的研究多是针对普通资源的盲筛,尽管通过高通量筛选能提高效率,但发现新活性物质的几率较低,成为制约先导化合物发现的瓶颈。由于特殊生境真菌资源的收集、整理以及培养的难度较大,制约了相关的研究,因而挖掘其代谢潜力对发现先导化合物、解析探索真菌的互作与环境适应机制都具有重要的意义。本课题组主要选择生存环境及互作关系独特的内生菌与冬虫夏草定殖真菌进行研究,高效发现新结构活性次生代谢产物。本文主要介绍近4年来我们在这方面研究中取得的进展。

蒿属植物内生真菌Penicillium sp.抗癌活性产物的液体发酵工艺优化

编号为GZUCCZY0012的青霉属内生真菌Penicillium sp.代谢产物中的物质A疑似为青蒿素类化合物,体外抗癌实验表明物质A对人前列腺癌细胞PC3和人非小细胞肺癌细胞A549具有中等的细胞毒活力。本实验以物质A的含量为主要指标,通过单因素实验和正交实验的考察,并结合PB和中心组合设计,优化确定了适合物质A积累的GZUCCZY0012液体发酵培养基和培养条件。研究结果表明:GZUCCZY0012发酵生产物质A的最优培养基为麦芽糖47.52 g/L、NH4Cl 14.82 g/L、K2HPO41.5 g/L、MgSO42.0 g/L、KCl 2.0 g/L、ZnSO40.5 g/L、CaCl20.5g/L、FeSO40.5 g/L,pH 6.0,接种量4%(V/V),于26℃下摇瓶发酵14 d,物质A的产量可以达到(144.61±7.56)μg/mL,比优化前的含量(32.30±2.28)μg/mL提高了3.48倍。

从红树林内生真菌筛选重组人DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂的研究

从6种红树林植物中分离到60株内生真菌。通过重组人DNA TopoisomeraseI(hTopoI)的松弛活性的抑制实验筛选发现:有45%的菌株代谢产物对hTopoI松弛质粒抑制活性的IC50小于1/2,并筛选到两株对hTopoI具有强烈抑制活性的内生真菌MF54和MF60,其IC50均为1/128。以上研究结果表明:一些红树林内生真菌的代谢产物对hTopoI表现出良好的抑制活性,有望从中发现潜在的抗肿瘤先导化合物。

利用紫外诱变选育楸灵素合成缺陷株

楸树内生真菌菌株FSN002次生代谢产物楸灵素具有优良的抗肝癌性能,选育突变株是研究楸灵素生物合成机制的重要手段。真菌孢子预培养13 h左右,萌发形成4–6个细胞的幼嫩菌丝,适合作为紫外诱变的出发材料。实验发现紫外光强度和照射时间对真菌致死率的影响符合线性模型,二者之间不存在明显的交互作用。当紫外光强度为90 000μJ/cm^2,时长为6 s时,真菌的致死率在95%左右。在上述优化选育诱变条件下,获得了1株楸灵素合成能力完全丧失的突变株和1株楸灵素合成能力下降到野生型16%的突变株,为下一步研究楸灵素的生物合成机制以及高效生产楸灵素奠定了基础。

美登木内生真菌Neocosmospora sp.的次级代谢产物研究

目的对美登木内生真菌Neocosmospora sp.中抗肿瘤活性次级代谢产物进行研究。方法结合LC-MS分析与MTT活性检测方法,采用反相ODS、反复硅胶柱色谱、高效液相色谱等方法对活性次级代谢产物进行分离纯化,并根据理化性质与波谱数据鉴定化合物结构。结果与结论从美登木内生真菌总次级代谢产物中分离得到12个化合物,分别鉴定为cyclotryprostatin B(1)、fumitremorgin C(2)、bisdethiobis(methylthio)gliotoxin(3)、spirotryprostatin A(4)、(6S,14S)-14,15-dihydro-6-methyl-6,14-(iminomethano)-5H-indolo-[2′,3′:4,5]azepino[2,1-b]quinazoline-12,15(6H)-dione(5)、fumiquinazoline C(6)、pseurotin A(7)、5α,8α-epidi-oxy-(22E,24R)-ergosta-6,22-dien-3β-ol(8)、5α,8β-epidioxy-24(S)-methylcholesta-6,9(11),22-triene-3β-ol(9)、(22E,24R)-3β,5α,9α-trihydroxyergosta-7,22-diene-6-one(10)、stigmasta-7,22-diene-3β,5α,6α-triol(11)、4-hydroxyphenethyl-2′(S)-hydroxypropanoate(12)。所有化合物均为首次从内生真菌Neocosmospora属中分离得到,化合物4对肺癌A549细胞具有较强的增殖抑制活性(IC^(50)=5.1μmol·L^(-1))。

一株具有抗菌和抗肿瘤活性的诺丽内生真菌的鉴定

为研究一株诺丽内生真菌M50的抗菌和抗肿瘤生物活性并鉴定此菌株,本研究对实验室保藏的诺丽内生真菌M50,采用ITS rDNA测序鉴定内生真菌M50;以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌为指示细菌,采用滤纸片扩散法对其次生代谢产物的抗菌性进行测试;以新暗色柱节孢菌、辣椒疫霉、西瓜枯萎病菌和拟盘多毛孢为指示真菌,采用平板对峙法对其抑菌性进行测试;以肝癌细胞株SMMC-7721、Lewis肺癌、前列腺癌细胞株PC-3为指示癌细胞,采用MTT法对其次生代谢产物的抗肿瘤活性进行测试。内生真菌M50鉴定为Leptoxyphium fumago;金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌抑菌圈的大小分别为(13.16±0.22) mm、(12.06±0.31) mm、(7.89±0.17) mm和(11.05±0.22) mm;新暗色柱节孢菌、辣椒疫霉、西瓜枯萎病菌和拟盘多毛孢的抑制率分别为50.00%、18.36%、12.35%和46.91%;肝癌细胞株SMMC-7721、Lewis肺癌、前列腺癌细胞株PC-3的半抑制浓度分别为45.46μg/m L、53.33μg/m L、80.48μg/m L。说明内生真菌M50具有广谱的抗菌和抗肿瘤的生物活性。本研究为解决药源问题带来新的希望和契机,为开发诺丽新产品提供理论依据和技术支撑。

三株紫苏内生真菌代谢产物抗肿瘤活性的研究

目的研究3株从紫苏中分离得到的内生真菌次生代谢产物抗肿瘤活性。方法取处于指数生长期的5种人肿瘤细胞(人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肺腺癌细胞株NCI-H1975、人结肠癌细胞株HT-29、人前列腺癌细胞株DU-145),将细胞分为实验组[内生真菌发酵产物乙酸乙酯萃取部分,菌株暹罗刺盘孢菌(ZC-J4)和产黄青霉(BP-Y6)产物给药浓度为25、50、100、300和400μg·mL^(-1),菌株嗜线虫镰刀菌(ZP-G1)产物给药浓度为1.56、3.13、6.25、12.5、25和50μg·mL^(-1))]、阴性对照组、阳性对照组(阳性药物阿霉素,给药浓度为0.06、0.13、0.25、0.50和1.00μg·mL^(-1))。处理48 h后,用噻唑蓝法(MTT)法测定肿瘤细胞的增殖状况,计算内生真菌代谢产物对肿瘤细胞生长的抑制率和半数抑制浓度(IC50);并通过液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)分析代谢产物中的主要成分。结果3株紫苏内生真菌发酵产物对肿瘤细胞的增殖有抑制效果,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性;不同菌株代谢产物抑制作用差异较大,ZP-G1的次生代谢产物表现出的抑制作用最强,尤其是对HepG2细胞和HT-29细胞,IC50值分别为(6.28±0.09)和(9.03±1.05)μg·mL^(-1);BP-Y6和ZC-J4的次生代谢产物对肿瘤细胞的毒性较弱,对NCI-H1975的IC50值均大于400μg·mL^(-1)。LC-MS结果分析表明,3种内生真菌的代谢产物含有部分相同成分,真菌ZP-G1中含有香紫苏二醇、杨梅素等成分,在其余2株真菌中未发现。结论紫苏内生真菌的部分菌株具有抗肿瘤活性,菌株ZP-G1对肿瘤细胞增殖的抑制效果较好,具有进一步开发抗肿瘤天然活性成分的潜力。

萝芙木内生真菌Colletotrichum acutatum的次级代谢产物研究

目的 对萝芙木内生真菌Colletotrichum acutatum中抗肿瘤活性次级代谢产物进行研究。方法 结合LC-MS分析与MTT活性检测方法,采用反相ODS、反复硅胶柱色谱及高效液相色谱等方法对活性次级代谢物进行分离纯化,并根据理化性质与波谱数据鉴定化合物结构。结果与结论从萝芙木内生真菌总次级代谢物中分离得到11个化合物,分别鉴定为alternariol 4-methl ether(1)、fusaproliferin(2)、对苯二甲酸二丁酯(3)、nectriapyrone(4)、heptadec-(9Z)-enoic acid(5)、bis-2-ethylhexyl-benzene-1,2-dicarboxylate(6)、psoralester(7)、1-linoleoylglycerol(8)、9-octadecenoic acid-2′,3′-dihydroxy propyl ester(9)、rigidiusculamide C(10)、sambutoxin(11)。其中除化合物4以外,其他化合物均为首次从内生真菌Colletotrichum属中分离得到,化合物3、7、8、11对肺癌细胞株A549和宫颈癌细胞株HeLa具有中等细胞毒性(IC_(50)≤50μmol·L^(-1))。