pEYFP-hApelin-R重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建与增强型黄色荧光蛋白(EYFP)融合的人Apelin-R(Human Apelin receptor,hApelin-R)真核表达载体,用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究。方法以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人Apelin-R。扩增的Apelin-R产物与质粒pEYFP-C1按常规方法酶切、连接、转化,并经酶切和测序进行鉴定。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,Western blot鉴定人Apelin-R的表达。用Apelin-13诱导后,共聚焦显微镜观察受体在细胞内的位移。结果扩增出了一条1143 bp的基因片段,序列与GenBank(NM_005161)相同。在69 kDa处有一蛋白条带,与预期大小相同。人Apelin-R表达在细胞膜上。诱导30 min后,发生受体向胞浆的位移。结论成功构建了pEYFP-hApelin-R重组表达载体,建立了该质粒转染HEK293的细胞模型。可用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究,其结果有助于寻找其作为药物的靶点。

含人Apelin-R重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP的构建

目的构建含有人Apelin受体(Apelin-R)基因的pDC316-apelinR-EGFP腺病毒穿梭载体,为糖尿病相关基因Apelin的体内研究提供新方法。方法 PCR方法分别扩增Apelin-R基因,测序正确后与载体pDC316-EGFP连接,构建重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP;脂质体法与腺病毒骨架载体共转染HEK293细胞进行重组腺病毒包装,稀释法测定腺病毒滴度。RT-PCR和Western blot方法检测Apelin-R的表达。结果限制性核酸内切酶鉴定及测序结果均证明Apelin-R基因成功扩增并克隆到重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP。在HEK293中成功包装出含Apelin-R的腺病毒Ad-apelinR-EGFP,病毒滴度为3.1×109TCID50/ml,感染Ad-apelinR-EGFP的HEK293E细胞中可检测到Apelin-R的mRNA和蛋白表达。结论成功构建了真核表达载体pDC316-apelinR-EGFP,得到了表达绿色荧光蛋白的Apelin-R腺病毒,该病毒有望用于糖尿病的体内研究实验。

Apelin-13通过NLRP3/caspase-1/GSDMD通路抑制脑缺血再灌注损伤小鼠细胞焦亡

目的:探究Apelin-13调节肽对脑缺血再灌注(I/R)损伤模型小鼠神经细胞焦亡的影响。方法:利用大脑中动脉栓塞再灌注法(MCAO/R)制备小鼠I/R损伤模型,氧糖剥夺/复氧(OGD/R)法制备HT22细胞损伤模型,同时给予Apelin-13处理。神经功能缺损评分评估小鼠神经功能;苏木精-伊红染色法(HE)和尼氏染色观察小鼠脑梗死区组织形态变化;2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑梗死体积;Western Blot检测梗死区脑组织或者HT22细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)等分子的表达;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清及培养上清中IL-1β和IL-18的水平;用CCK-8试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒分别检测HT22细胞活性和细胞损伤;caspase-1活性检测试剂盒检测HT22细胞中caspase-1的活性;免疫荧光染色观察HT22细胞中caspase-1和GSDMD表达。结果:Apelin-13可显著改善I/R小鼠神经功能和脑梗死体积,减轻梗死区病理损伤。同时降低血清中IL-1β和IL-18的水平。此外,Apelin-13可降低小鼠脑梗死区NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-1β、IL-18等分子的表达。体外实验表明Apelin-13可显著增加OGD/R处理的HT22细胞活力,降低caspase-1活性,并减少LDH含量,同时降低OGD/R处理的HT22细胞中NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-1β、IL-18等分子的表达。结论:Apelin-13可通过NLRP3/caspase-1/GSDMD通路抑制脑缺血再灌注损伤小鼠细胞焦亡,进而发挥神经保护作用。

室旁核注射Apelin-13加重大鼠缺血-再灌注胃黏膜细胞凋亡

目的研究大鼠室旁核(PVN)注射Apelin-13对胃缺血-再灌注(GI-R)的损伤作用及其细胞机制。方法PVN内微量注射Apelin-13,制备GI-R模型,用免疫组化方法检测胃黏膜细胞的凋亡、增殖及凋亡相关基因BCL-2和BAX的表达。结果(1)注射0.2、1.0和5.0μgApelin-13到PVN,GI-R损伤显著加重,且有剂量-效应依赖关系;(2)与GI-R组相比,注射Apelin-13能明显增加GI-R后胃黏膜细胞的凋亡,减低胃黏膜细胞的增殖,同时可以增加促凋亡因子BAX蛋白的表达,明显降低抗凋亡因子BCL-2蛋白的表达。结论室旁核内注射Apelin-13可促进胃黏膜细胞的凋亡、抑制其增殖,对GI-R损伤产生显著的加重作用。

室旁核注射apelin-13对大鼠胃缺血/再灌注损伤的影响

目的研究室旁核注射apelin-13对胃缺血/再灌注(GI/R)损伤的作用及细胞机制。方法室旁核注射apelin-13,制备GI/R模型;用Western-blot方法检测胃黏膜细胞的凋亡以及凋亡相关基因c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化水平。结果与单纯GI/R组相比,室旁核注射apelin-13能明显增加GI/R后胃黏膜细胞的损伤,同时可以升高caspase-3蛋白表达及JNK的磷酸化水平。结论室旁核注射apelin-13对大鼠GI/R损伤具有加重作用。

Apelin-13对局灶性脑缺血再灌注后大鼠皮质Akt和磷酸化Akt表达的调节

目的探讨外源性Apelin-13对局灶性脑缺血再灌注大鼠皮质Akt及p-Akt表达的影响。方法 Wistar大鼠132只,按随机数字表法均分为假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血再灌注后Apelin-13干预组。线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,Moor VMS-LDF1激光多普勒血流仪检测模型组脑缺血前、后脑血流变化,免疫组织化学显色、免疫印迹分析方法检测顶叶皮质Akt和p-Akt表达变化。结果模型组大鼠脑缺血后脑血流量明显低于缺血前,脑缺血模型建立成功。缺血再灌注组皮质Akt表达较假手术组少,Apelin-13干预组皮质Akt表达高于缺血再灌注组。缺血再灌注组皮质pAkt表达高于假手术组,Apelin-13干预组p-Akt表达高于缺血再灌注组。结论外源性Apelin-13上调了脑缺血再灌注损伤大鼠皮质Akt和p-Akt蛋白表达。

当归补血汤含药血清对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的:观察当归补血汤含药血清对缺氧/复氧模型大鼠心肌微血管内皮细胞增殖及促血管内皮生长因子的影响。方法:将缺氧/复氧心肌微血管内皮细胞模型大鼠随机分为模型组及当归补血汤含药血清低、中、高剂量(5%、10%、20%)组,另设正常对照组,干预8小时后,MTT法检测各组大鼠细胞的细胞增殖活力,同时检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;Transwell法检测细胞迁移能力;酶联免疫吸附法检测细胞上清液中血管内皮生长因子、受体蛋白内源性配体(Apelin)含量。结果:当归补血汤含药血清干预后心肌微血管内皮细胞损伤明显减轻,细胞增殖活力及迁移能力明显改善,细胞上清液中血管内皮生长因子、Apelin含量明显增加,呈剂量依赖。结论:当归补血汤含药血清能明显促进大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生能力,其机制可能与促进血管生长相关细胞因子分泌有关。

Apelin-13对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究

目的:研究Apelin-13对缺血/再灌注小鼠脑损伤的作用,并初步探讨其对自噬性细胞死亡的影响。方法:取健康雄性CD-1小鼠,随机分为假手术(sham)组、生理盐水(Saline)组、Apelin组;Apelin组和Saline组首先建立脑缺血再灌注(MCAO/R)模型,再灌注即刻给予同侧侧脑室注射Apelin-13或等量生理盐水,然后在再灌注48 h后,进行神经功能方面检测,同时利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评估脑梗死体积;缺血再灌注24 h和48 h后,采用West-blot法检测各组自噬相关蛋白LC3的表达情况。结果:Apelin-13可显著降低小鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损症状,减少脑梗死体积,减低自噬相关蛋白LC3的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。结论:Apelin-13对小鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用,抑制神经细胞的自噬性死亡可能是其作用机制之一。