溶藻弧菌AphB蛋白的原核表达及其乙酰化验证

【目的】研究LysR家族转录因子AphB蛋白是否存在乙酰化修饰,为进一步研究乙酰化修饰对该蛋白功能的影响提供理论基础。【方法】以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 LysR家族转录因子AphB为对象,根据GenBank上溶藻弧菌aphB序列(No.WP_005380599.1)设计引物,采用大肠杆菌表达体系异源诱导表达,设置时间、温度和IPTG浓度梯度优化表达条件,最后纯化AphB蛋白,通过抗乙酰赖氨酸特异性抗体验证AphB蛋白的乙酰化修饰程度。【结果】aphB全长约876 bp,37℃时菌液加入0.1 mmol·L^(-1)的IPTG诱导6 h后,AphB蛋白的表达量最高,纯化后的蛋白大小为37.3 kD,AphB自身存在乙酰化修饰位点,但其乙酰化程度在体外不受脱乙酰酶CobB的调控。【结论】初步证明了AphB蛋白是一种乙酰化蛋白且在体外不能被脱乙酰酶CobB脱乙酰化,研究结论丰富了原核生物弧菌中乙酰化修饰的相关理论,为溶藻弧菌毒力基因aphB的翻译后调控机制研究提供了科学参考。

霍乱弧菌中调控aphB的基因筛选及其功能

【目的】筛选霍乱弧菌C6706-中调控LysR家族蛋白AphB表达的基因。【方法】将霍乱弧菌埃尔托型菌株C6706-aphB启动子区克隆到2个报告质粒pBBRLux和pKP302上,并将其导入霍乱弧菌C6706-中,以此作为出发菌株。利用出发菌株与转座子pSC123接合构建LZV630-302转座子随机突变文库,通过测定化学发光强度检测aphB启动子的表达水平,筛选aphB表达受影响的突变株。利用随机PCR方法检测转座子插入位点,并测序比对分析基因。【结果】从7个转座子库中(共约4万个突变株)得到能影响aphB表达(均导致下降)的2株突变株T1和T2。测序比对发现T1中转座子插入在vc1585读码框内,T2中转座子插入在距vc1602基因末端7 bp处。【结论】获得aphB表达改变的突变株,基因vc1585和vc1602可能直接或间接影响aphB表达,为进一步研究aphB表达调控影响因素奠定了基础。

霍乱弧菌转录调控因子AphBC端结构域的原核表达与纯化结晶

目的 AphB是霍乱弧菌毒力基因表达调控网络中重要的转录调控因子,可激活毒力基因表达,本实验目的在于得到AphB蛋白C端结构域的晶体结构,为研究其与辅助诱导物结合之后的构象改变对于毒力调控网络的影响奠定基础。方法以霍乱弧菌的AphB蛋白C端结构域为对象,将目的基因克隆到表达载体pET-32a(+)上,使重组质粒在大肠埃希菌中高效表达目的蛋白,然后利用镍离子亲和层析、MonoQ离子交换层析和GF75凝胶过滤层析法进行纯化。分别选取5、10、20和30mg/ml的目的蛋白,采用悬滴气相扩散法进行蛋白结晶,筛选结晶试剂盒条件,在得到初晶的结晶条件基础上通过改变蛋白与池液混合比例、结晶池液成分、环境温度等进行结晶条件的优化。结果含有目的基因的重组质粒在大肠埃希菌中高效表达可溶性目的蛋白。利用3种蛋白纯化方法依次进行纯化,得到较高纯度的目的蛋白。对蛋白结晶试剂盒结晶条件进行优化,得到的最优结晶条件为:蛋白浓度为30mg/ml;池液成分为0.1mol/L BIS-TRIS,2.0mol/L Ammonium sulfate,pH 5.0,18℃环境孵育24h。用优化的结晶条件进行结晶处理,得到分辨率为2.1的蛋白晶体。结论通过原核表达和用优化的结晶条件得到了霍乱弧菌AphB蛋白C端结构域的蛋白晶体,所得数据为蛋白的空间结构解析提供了重要依据,对蛋白C端结构域与辅助诱导物结合的功能研究奠定了基础。

氧压抑制霍乱弧菌毒力表达的机制研究

目的外界环境因素会对霍乱弧菌的毒力表达产生影响,AphB作为霍乱弧菌毒力调控网络中的关键因子,受氧压抑制作用明显。本实验旨在研究氧压抑制AphB活性的关键位点及机制。方法利用诱变菌株XL1Red对aphB基因进行随机突变,获得突变子文库;将受到AphB调控的tcpP基因的启动子区域与lux报告基因相融合,获得检测用报告质粒;取含有aphB突变基因及报告质粒的菌株在有氧条件下进行培养,通过检测Lux值筛选目标突变株;利用细菌双杂交系统,进一步研究筛选到的突变位点感受氧压的机制。结果筛选到的突变株S267L、M113I和M244I在有氧条件下均表现出高转录调控活性,分别是WT(野生型)的22.8、173.3、30.2倍(P<0.001)。霍乱弧菌验证S267L、M113I是WT的8.2、13.3倍,M244I是WT的14.8倍(P<0.01)。细菌双杂交实验结果表明M113I通过改变蛋白聚合能力从而抵抗氧压的抑制作用。结论S267、M113和M244为氧压抑制AphB活性的关键位点。