人可溶性APO2L/TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 利用基因工程技术原核表达人可溶性APO2L并复性纯化成具生物活性形式。方法 用PCR方法扩增APO2LcDNA(密码子 1 1 4～ 2 81 )并克隆至表达载体 ,重组体转化大肠杆菌JF1 1 2 5摇瓶发酵 ,筛选高表达克隆于发酵罐经温度诱导表达。经盐酸胍溶解 ,空气氧化法稀释复性 ,超滤 ,Q SepharoseFF阴离子交换柱层析等方法纯化人可溶性APO2L。利用流式细胞术检测产物对细胞的诱导凋亡活性。结果 表达产物约占菌体总蛋白质的 2 0 %并在菌体内形成了包涵体 ,SDS PAGE鉴定表达产物相对分子质量约 2 1 0 0 0。经上述纯化蛋白质纯度达 90 %以上 ,蛋白质可溶性好。观察到人可溶性APO2L诱导人宫颈癌HeLa细胞发生明显的凋亡。

rh-Apo2L联合长春瑞滨对诱导肺鳞癌细胞凋亡作用及机制的研究

目的晚期肺鳞癌治疗方式相对有限。Ⅲ期临床试验提示,rh-Apo2L有望为其提供一种新颖、有效的治疗方法。本研究旨在观察rh-Apo2L、长春瑞滨及两药联合对人肺鳞癌细胞SK-MES-1的抑制增殖和促进凋亡作用,并探讨其机制。方法将不同质量浓度的rh-Apo2L、长春瑞滨干预人肺鳞癌SK-MES-1细胞,采用CCK8法检测细胞增殖;AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白DR4、DR5和Caspase-3的表达。结果通过CCK8检测发现,rh-Apo2L对人肺鳞癌细胞SK-MES-1的体外增殖具有抑制作用,24和48h的IC50分别为28.57和8.97μg/mL;长春瑞滨对人肺鳞癌细胞SK-MES-1的体外增殖具有抑制作用,24和48h的IC50分别为27.30和7.87μg/mL。其中,1μg/mL rh-Apo2L组、1μg/mL长春瑞滨组和两药联合组(rh-Apo2L和长春瑞滨质量浓度均为1μg/mL)的24h细胞增殖抑制率分别为(15.03±1.54)%、(21.88±2.75)%和(65.11±4.09)%;0.1μg/mL rh-Apo2L组、0.5μg/mL长春瑞滨组和两药联合组(rh-Apo2L质量浓度为0.1μg/mL,长春瑞滨为0.5μg/mL)的48h细胞增殖抑制率分别为(19.01±1.12)%、(19.97±1.23)%和(84.81±3.99)%;24和48h联合组两药相互作用指数(q值)分别为1.94和2.40。细胞凋亡实验结果显示,1μg/mL rh-Apo2L组、1μg/mL长春瑞滨组和两药联合组(rh-Apo2L和长春瑞滨质量浓度均为1μg/mL)干预细胞24h的凋亡率分别为(21.76±3.13)%、(37.31±2.21)%和(74.88±3.63)%;与单药组相比较,两药联合组对SK-MES-1细胞增殖的抑制作用明显增强(P<0.001),两药联合干预24h的凋亡指数显著升高,P<0.001。蛋白印迹法检测结果发现,rh-Apo2L联合长春瑞滨在上调DR4(P=0.026)和DR5(P=0.001)表达方面具有交互作用,在增加Caspase-3活性片段表达亦具有交互作用,P=0.011。结论 rh-Apo2L与长春瑞滨均能协同抑制人肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与上调SK-MES-1细胞表面的DR4、DR5蛋白表达和活化Caspase-3相关。

Rh-Apo2L联合长春瑞滨杀伤人肺腺癌A549细胞的作用研究

[目的]探讨重组人凋亡素2配体(Rh-Apo2L)联合长春瑞滨(NVB)对人肺腺癌A549细胞的杀伤作用及机制。[方法]人肺腺癌A549细胞分成4组:对照组、Rh-Apo2L组、NVB组、联合组。用MTT法检测不同浓度Rh-Apo2L和NVB对A549细胞的抑制率,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期分布,RT-PCR方法检测死亡受体DR5基因mRNA的表达。[结果]MTT结果显示不同浓度Rh-Apo2L和NVB对人肺癌A549细胞的体外抑制作用均呈剂量效应关系,Rh-Apo2L处理48h后的IC20为3.48μg/ml、IC50为197.92μg/ml,NVB处理48h后的IC20为0.29μg/ml、IC50为3.44μg/ml。联合组对A549细胞的抑制作用高于单药组(P=0.001)。流式细胞分析显示含NVB药物两组在24hG2/M期比率高于对照组。3个实验组在24h、48h、72h后DR5基因mRNA相对表达量均较对照组多(P<0.05),但各实验组间均无统计学差异(P>0.05)。[结论]Rh-Apo2L与NVB联合应用能协同增强对人肺腺癌细胞株A549的体外抗肿瘤活性,其协同作用机制可能与细胞周期阻滞在G2/M期有关,但与DR5基因mRNA的表达无相关性。

Apo2L和足叶乙甙、阿糖胞苷体外协同抑制白血病细胞增殖

目的 研究化疗药足叶乙甙 (Vp16 )或阿糖胞苷 (Ara C)上调HL 6 0细胞DR5基因表达 ,并增强凋亡素 2配体 (Apo2L)诱导HL 6 0细胞凋亡的作用。方法 通过AnnexinⅤ /PI染色 ,流式细胞仪检测HL 6 0细胞的凋亡率 ;通过MTT试验检测Apo2L对白血病原代细胞的生长抑制率 ;利用半定量RT PCR检测HL 6 0细胞DR5基因表达的变化。结果 ①Apo2L能诱导HL 6 0细胞凋亡 ,存在剂量 效应关系 ;②Apo2L能抑制白血病原代细胞生长 ,但不同类型原代细胞敏感性存在明显差异 ;③Vp16或Ara C能上调HL 6 0细胞DR5基因表达 ,Vp16或Ara C可和Apo2L协同诱导HL 6 0细胞凋亡。结论 Apo2L能诱导HL 6 0细胞凋亡 ,抑制白血病原代细胞生长 ;化疗药Vp16或Ara C能上调HL 6 0细胞DR5基因表达 ,并增强Apo2L的诱导细胞凋亡作用 ;Apo2L有可能成为一种新型抗肿瘤制剂。

WtCosmc质粒转染对Tn^+肿瘤细胞恶性行为的影响

目的：以Tn＋肿瘤细胞为靶标,研究野生型Cosmc（WtCosmc）质粒转染对其恶性行为的影响,以期为肿瘤的诊断及治疗提供新思路.方法：流式细胞术检测肿瘤细胞表面Tn抗原阳性率,免疫磁珠分选Tn＋与Tn-肿瘤细胞;分选后的Tn＋肿瘤细胞经Fugene 6转染WtCosmc质粒,并用免疫荧光检测细胞表面Tn抗原表达状况.分别采用荧光法、CCK-8和Transwell检测转染前后Tn＋肿瘤细胞的T-synthase活性、细胞增殖、迁移能力及对Apo2L/TRAIL的敏感性.结果：与Tn-细胞相比,Tn＋肿瘤细胞T-synthase活性及对Apo2L/TRAIL诱导凋亡的敏感性较低;细胞增殖、迁移能力较强.经WtCosmc质粒转染后,Tn＋细胞T-synthase活性及其对Apo2L/TRAIL诱导凋亡的敏感性明显增高;Tn抗原表达受抑;细胞增殖及迁移能力明显下降.结论：转染WtCosmc可恢复Tn＋细胞T-synthse活性,抑制Tn抗原的表达,进而增强其对Apo2L/TRAIL诱导凋亡的敏感性,降低细胞增殖、迁移能力,有效抑制Tn＋肿瘤细胞的恶性行为.

重组人凋亡素2配体治疗晚期恶性肿瘤Ⅰ期临床耐受性研究

目的：观察晚期恶性肿瘤患者对重组人凋亡素2配体（rh—Apo2L，又称肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）静脉滴注后的安全性。方法：rh—Apo2L皮试阴性的志愿者，接受该药静脉滴注2h，qd，连用14d，观察14d；按“3＋3”原则进行剂量爬坡，每组3～6例。结果：入组22例，2例皮试阳性退出研究。rh—Apo2L由10递增至300μg·kg^-1·d^-1共6个剂量组。除Ⅲ度全身炎性反应综合征，其余均为Ⅰ～Ⅱ度不良反应，包括发热、疲劳、乏力、皮肤黏膜改变、消化道反应、心血管系统毒性、骨髓抑制和肝肾功能损伤；所有毒性均可在停药2周内恢复；最大耐受剂量为200μg·kg^-1·d^-1.结论：恶性肿瘤患者采用rh—Apo2L静脉滴注后的安全性良好，推荐进行Ⅱ期临床研究。

肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体与放、化疗联合应用诱导喉癌Hep-2细胞凋亡途径研究

目的探讨肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的敏感性及其与放、化疗联用时的凋亡途径。方法采用CCK-8法检测TRAIL、顺铂、紫杉醇作用下Hep-2细胞生长抑制率;流式细胞仪检测Hep-2细胞凋亡率;Westernblot法检测Hep-2细胞内caspase蛋白表达变化。结果Hep-2细胞对TRAIL诱导的凋亡不敏感,24hIC50为596.92μg/L;顺铂、紫杉醇、放射线与TRAIL联合应用时Hep-2细胞凋亡率显著高于单药应用(P<0.05);caspase-9抑制剂Z-LETD-FMK使TRAIL、顺铂、紫杉醇对Hep-2细胞的生长抑制率显著下降(P<0.05);联合用药组caspase-8、caspase-9表达量均有显著升高(P<0.05)。结论人喉癌Hep-2细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡不敏感,TRAIL通过内源性途径诱导Hep-2细胞凋亡;活化后的caspase-9、caspase-3通过环状反馈作用激活caspase-8,增强了Hep-2细胞对TRAIL的敏感性,是联合用药对Hep-2细胞发挥协同效应的机制之一。

TRAIL包涵体在细胞内重折叠现象的初步研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Apo2L/TRAIL)是一种新型的抗肿瘤蛋白。但在大肠杆菌表达系统中,表达的TRAIL蛋白往往容易聚集形成包涵体。本文对重组TRAIL包涵体在胞内重折叠转化成可溶性TRAIL蛋白作了初步探索,结果表明:当蛋白表达后,迅速降低温度至30℃并添加50μg/mL氯霉素继续培养4 h,可溶性TRAIL产量可提高至16.7%。这一结果在3.7L罐上也得到了证实,可溶性TRAIL表达量达到14.5%。

选择性杀癌细胞物:TRAIL/Apo-2L

研究发现了一种能选择性诱导癌细胞发生自杀的蛋白-TRAIL,肿瘤细胞对它比正常细胞敏感得多,且其作用独立于P53。关于其选择性杀伤作用机制的研究,近期取得了突破性进展。现将其蛋白、基因及其受体的结构、分布及作用机制进行综述。

提高重组TRAIL表达产率的优化策略

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Apo2L/TRAIL)是一种新型的抗肿瘤蛋白。针对缩短发酵周期,提高生产效率这一目标,首先在摇瓶中利用响应面设计优化发酵表达条件,总TRAIL蛋白的表达量提高到25.7%。在此基础上研究了发酵条件对可溶性TRAIL蛋白表达量的影响。于3.7L发酵罐放大进行补料-分批发酵实验时,单位菌体可溶性TRAIL蛋白的表达量提高了67%,实现了在大肠杆菌高密度培养过程中单位细胞重组TRAIL蛋白的可溶性表达和体积生产率的提高。