凋亡相关蛋白Apr-2的克隆、测序及初步表达

目的 :从HL 6 0细胞凋亡模型中克隆凋亡相关蛋白Apr 2编码区基因 ,并对其进行表达 ,为进一步研究Apr 2的结构功能及多克隆抗体的制备奠定基础 .方法 :建立HL 6 0细胞凋亡模型 ,提取HL 6 0凋亡细胞总RNA ,以RT PCR方法获取Apr 2cDNA编码区全序列 ,将其与PGEM TEasy载体连接 ,转化E .coliDH5α ,构建重组克隆载体PGEM TEasy/apr 2 ,测序正确后 ,将目的片段亚克隆入PGEX 4T 2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,IPTG诱导重组蛋白质表达 ,分析蛋白质在细菌中的表达分布 ,进行凝胶自动扫描分析 .结果 :序列分析表明 ,与GenBank中已登录的Apr 2cDNA编码区序列比较 ,完全一致 .表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的 4 0 %以上 ,主要以包涵体的形式存在 .结论 :成功的获得了细胞凋亡模型HL 6 0中Apr 2cDNA编码区的克隆及其融合蛋白表达产物 .

凋亡相关蛋白Apr-2的融合表达及多克隆抗体的制备

目的 融合表达凋亡相关蛋白Apr 2 ,并用该融合蛋白制备多克隆抗体。方法 将凋亡相关蛋白Apr 2克隆入PGEX 4T 2原核表达载体 ,转化大肠杆菌 ,IPTG诱导重组蛋白GST Apr 2表达 ,用该融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 ,经ELISA及Westernblot检测。结果 融合表达蛋白GST Apr 2主要以包涵体的形式存在 ,表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的 4 0 %以上。抗体效价为 1∶5 0 0 0。结论 已成功地进行Apr 2的融合表达 。

枯草杆菌Ki－2－132高表达遗传工程系统的研究

利用芽孢杆菌多效调控基因ｈｐｒ、ｄｅｑＱａ、ｄｅｇＲ、ｄｅｇＵ／５３２（Ｈｙ）等和枯草杆菌Ｋｉ－２－１３２自身的积生孢、感受态相关基因的协调作用，构建了系列的高表达遗传工程宿主。这些宿主对于ＡＰｒＥ都实现了较高水平的表达。其中，由ｈｐｒ和ｃｏｍ、ｓｐｏ等配合的宿主表达ＡｐｒＥ的能力比野生型宿主提高了１００—２００倍。

紫叶油菜硫同化还原酶基因APR2的克隆及在拟南芥中的遗传转化

紫叶油菜品系XY-PL是通过甘芥杂交获得的一个高世代重组自交系,其紫叶表型稳定、花青素含量高、主要农艺性状良好,是一个潜在的高花青素育种的中间材料。为探讨XY-PL紫叶表型与硫同化代谢关键酶APR2的关系,采用同源克隆法分别克隆了XY-PL和绿叶油菜品种中双11号(ZS11)的APR 2基因,共获得3条差异序列,分别命名为PL-APR 2、GL-APR2.1和GL-APR2.2。序列分析表明,它们均由4个外显子和3个内含子组成,其编码产物均具有典型的叶绿体转运肽序列,序列之间的一致性为98.2%~99.1%,在系统进化关系上与十字花科植物来源的APR2亲缘关系最近。相对于GL-APR2.1和GL-APR2.2,PL-APR2在叶绿体转运肽转运功能区存在3个氨基酸残基(51SLK53)缺失,可能影响其前体蛋白的跨膜转运,进而影响硫的同化与利用效率。在拟南芥中过表达结果表明,PL-APR 2转基因株系在T 0—T 2代均未表现出紫叶表型,可能与转化受体材料内存在野生型AtAPR 2有关。下一步将采用拟南芥apr2突变体作为遗传转化受体进行继续验证,并将对其叶绿体转运肽转运功能进行深入分析。