猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板,PCR方法扩增出apxⅢA基因3.1kb的片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定,并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apxⅢA基因进行比较,结果显示核苷酸同源性均在96%以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ/SalⅠ位点,成功构建了重组表达载体pGEX-apxⅢA,转化大肠杆菌BL-21(DE3)中并获得表达。SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白分子量约为140Ku,与预测相符,Westernblot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅢA基因的克隆及序列分析

为了给进一步研制基因工程疫苗和建立诊断方法提供依据,试验以猪胸膜肺炎放线杆菌(App)血清8型菌株的基因组DNA为试验材料,采用PCR技术和常规T-A克隆法,通过PCR鉴定及序列测定将所测得的apxⅢA基因序列与GenBank上发表的编码序列进行同源性分析比较。结果表明:本菌株apxⅢA基因的核苷酸序列与GenBank上血清2型和8型的同源性分别为96.3%和99.7%,不同部位位于基因的3′末端;推测氨基酸的同源性分别为94.8%和99.7%,不同部位主要位于富含甘氨酸的重复区。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅲ A基因的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

应用PCR方法扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinabacillus pleuropneumoniae,App)编码毒素A结构蛋白的完整基因,连接到载体pMD18-T中,经Not和Snab双酶切后连接到用同样酶切的表达载体pPIC9k上,转化GS115酵母感受态细胞,经甲醇诱导表达了分泌到胞外的Apx A蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白约为110 000,与预期相符。Dot-blot和ELISA检测结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。为进一步研究Apx A蛋白的结构和功能,研制App重组诊断抗原或亚单位疫苗奠定了基础。