猪胸膜肺炎放线杆菌江西分离株ApxIVA基因PCR扩增及基因分析

猪胸膜肺炎是引起保育到育肥阶段猪生产性能下降的一种重要传染病,该病的发生往往与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等病毒混合感染,引起猪群大批死亡,严重危害养猪生产。该病的病原为胸膜肺炎放线菌(APP),为促进江西省养猪业的发展,控制猪胸膜肺炎的流行,项目组从病原入手进行研究,前期已经分离到多株APP,并已经初步鉴定血清型。试验针对其毒素ApxIVA基因进行研究,参考NCBI上登录号为AX002405的ApxIVA毒素基因,设计目的基因大小为1 284 bp的特异性引物1对,并在上下游引物内加入酶切位点EcoRⅠ与SalⅠ进行毒素基因克隆。结果表明江西源APP应用PCR方法扩增ApxIVA基因,产物插入克隆载体,测序后与NCBI发表的APP ApxIVA基因序列对比分析,同源在98%以上,表明成功克隆到APP的ApxIVA基因。通过与10个国内外APP基因序列对比,发现本菌株与CP000569、FJ848575、FJ848573、GQ332268同源性较高,其中FJ848575、FJ848573、GQ332268均为中国分离株,CP000569为加拿大分离株。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断方法的建立及耐药性调查

为建立快速诊断猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的方法和耐药情况,根据Gen Bank中的APP apx IVA基因,设计合成2对引物,通过环介导等温扩增技术(LAMP)扩增条件的优化,建立了APP LAMP诊断方法,同时对分离到的APP进行耐药性分析。结果显示,建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为2 pg/μL,对猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性,扩增反应30 min内完成,结果肉眼可见。分离得到的31株APP,耐药性较强。结果表明,建立的方法可满足基层现场快速检测需要,对分离得到的31株APP耐药性分析表明,APP耐药性较严重。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP方法的建立

为建立快速检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）的鉴别方法，衣研究根据APP ApxIVA基因的保守区设计6条环介导等温扩增（LAMP）引物，利用Loopamp Realtime Turbidimeter LA-320c实时浊度仪对反应体系和条件进行优化，建立了APP的LAMP方法。结果显示：该方法在64℃下反应15rainDNA即可出现扩增，扩增后2～3min内即可判定结果，最低检测限为0．307ng／L，具有良好的重复性及稳定性，与其他病原菌无交叉反应，同时，试验结果可实现肉眼可视化观察。采用建立的LAMP方法与SN／T14472011标准公布的方法同时对36份临床疑似APP样品进行检测分析，结果显示：APP阳性10份，阴性26份，两种方法的符合率为100％。本研究建立的方法为防止猪传染性胸膜肺炎的传播提供了有效的检测手段。