长角血蜱唾液腺Apyrase的生物学特性和功能的研究

长角血蜱在吸血时 ,其唾液腺中的 apyrase可明显地抑制由 A DP所诱导的血小板聚集反应 ,并呈剂量反应关系 ,1/ 2对唾液腺可以完全抑制血小板的聚集反应。通过 apyrase的动力学、 HPLC分子筛、等电聚焦电泳和温度敏感性实验证明 ,水解 ATP和 ADP并不是 ATP酶、 ADP酶或几种酶共同作用的结果 ,而是一种酶即 apyrase的作用结果。Apyrase对 Ca2 +具有依赖性。而 Mg2 +、Zn2 +、Mn2 +对之影响较小 ,Hg2 +和EDTA是 apyrase的抑制剂。吸血对蜱唾液腺 apyrase活性影响较大 ,吸血 6天时其活性最大 ,吸血后活力明显下降。A pyrase与哺乳动物的 5′-核苷酸酶相似 ,它是一种糖基 -磷脂酰肌醇 ( GPI)膜锚结构蛋白。

志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:克隆编码志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的基因phoN2并实现表达,纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠抗Apyrase的多克隆抗体,并对多克隆抗体进行评价。方法:通过PCR扩增的志贺菌5a M90T中的基因phoN2克隆至表达载体pET24a中,将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达并纯化Apyrase-HIS融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多抗。Western blot、ELISA、免疫荧光鉴定获得的抗血清。结果:成功构建了原核表达载体pET24a-Apyrase,经诱导表达出相对分子量为28 kD的融合蛋白,用纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备的多克隆抗体,通过Western blot、ELISA、免疫荧光法证明多克隆抗体制备成功。结论:成功制备了志贺菌福氏5a特异性的鼠多克隆抗体,为进一步研究Apyrase蛋白在志贺菌福氏5a M90T中的表达、定位及志贺菌福氏5a M90T的快速检测奠定了基础。

PagAPY1基因调控银腺杨耐旱性的作用机制研究

【目的】Apyrase是水解细胞内/外核苷磷酸的关键酶,在调控植物生长发育和逆境响应中起重要作用。本研究鉴定银腺杨(Populus alba×P.glandulosa)中PagAPY1的分子功能,揭示其促进耐旱性的作用机制。【方法】利用生物信息学方法鉴定银腺杨PagAPY1基因,构建PagAPY1-YFP融合蛋白,观察PagAPY1的亚细胞定位,利用农杆菌介导的转基因技术获得过表达PagAPY1转基因银腺杨,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测野生型和转基因杨树中PagAPY1及其他抗逆基因表达,分析干旱胁迫下野生型和转基因杨树生长表型、根系发育和叶片保水性能等生理指标。【结果】PagAPY1具有Apyrase保守结构域,定位于高尔基体中,参与水解NTP/NDP。PagAPY1表达受干旱胁迫诱导。在干旱胁迫下,PagAPY1过表达杨树的存活率、根系生物量和不定根生长等相比野生型显著提高;同时,过表达杨树的气孔开度相比野生型降低。与野生型相比,过表达株系对ABA诱导的气孔关闭更为敏感。此外,过表达株系中活性氧信号和抗氧化酶相关基因在干旱胁迫下显著上调表达。【结论】干旱胁迫下,PagAPY1通过维持蛋白糖基化和胞外ATP(eATP)稳态平衡,促进生长素极性运输,提高根系生长,促进气孔闭合,减少叶片水分散失,同时激活活性氧信号,增加抗氧化酶系统活性,从而提高了杨树抗旱性。

培养的牛心内膜内皮细胞水解细胞外腺苷酸<英文>

目的:研究牛心内膜内皮细胞(BEEC)腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)的特性并比较牛心内膜及血管内皮细胞的胞外腺苷酸酶活性。方法:以反相HPLC测定核苷酸含量,以磷离子释放法检测apyrase活性。结果:叠氮钠10mmol·L^(-1)和氟化钠20mmol·L^(-1)分别抑制BEEC apyrase 51％及38％活性,而Na^+/K^+ -ATP酶抑制剂哇巴因则对BEEC apyrase活性无影响。过氧化氢0.5mmol·L^(-1)呈时间依赖性地抑制心内膜内皮细胞apyrase活性。BEEC的apyrase活性低于主动脉内皮细胞的apyrase活性,而BEEC的胞外AMP酶则远较血管内皮细胞的活性高。结论:BEEC apyrase具有叠氮钠和氟化钠敏感的、哇巴因不敏感的特性;与血管内皮细胞相比,BEEC apyrase活性较高而胞外AMP酶活性较低。

生物发光法测定天然水体细菌数量中游离ATP的去除

天然水体中存在浮游动植物等体细胞和游离ATP,会对细菌ATP的测定产生严重的干扰,所以探究体细胞和游离ATP的消除方法是生物发光法测定细菌总数中不可缺少的预处理步骤.本文研究了体细胞提取剂Tritonx-100的最适浓度和最适提取时间,游离ATP水解酶apyrase的最适浓度和对细菌ATP测定的影响,并将包含Tritonx-100和apyras e酶的体细胞排除体系应用于实际天然水体细菌数量的测定.结果显示,0.4%的Tritonx-100作用水样2 min能够有效提取水样中的体细胞;Apyrase酶浓度达到0.2 U时能够有效水解水样中的游离ATP;Apyrase酶的加入对细菌无水解作用,对细菌ATP的测定无明显影响;包含Tritonx-100和apyrase酶的体细胞排除体系能够裂解体细胞而不会对细菌ATP的测定造成显著影响;应用于实际天然水体的结果也表明,体细胞排除体系可为ATP生物发光法准确测定环境样品中的细菌数量创造条件.本研究表明,经Tritonx-100和apyrase酶处理后,基本能够排除体细胞和游离ATP的干扰,得到天然水体中的实际细菌总数.