花生致敏原Ara h 1的重组表达与纯化

Ara h 1是花生中含量最高的过敏原,也是致敏性较高的蛋白之一。目前提纯Ara h 1的方法大多涉及2至3步柱层析,步骤繁琐且成本较高。本文中,将带有6×his标签的Ara h 1基因与pET-32a表达载体融合,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导使其表达目标蛋白。菌体裂解后使用Ni-NTA吸附、梯度洗脱对Ara h 1进行纯化。采用质谱及Western-blot鉴定纯化蛋白的种类及免疫活性。结果显示,质粒中目标基因的序列与NCBI数据库中Ara h 1的基因数据相符;300 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷22℃诱导菌液22 h时蛋白表达量最高;添加15 mmol/L十二烷基磺酸钠可将蛋白释放到上清液中,使用含50,100 mmol/L咪唑的洗脱液分别洗脱2次和1次后得到纯度较高且免疫原性良好的重组Ara h 1。

花生致敏蛋白Ara h 1双抗体夹心ELISA法的建立

为建立用于花生致敏蛋白Ara h 1快速、灵敏、特异检测的双抗体夹心ELISA法,以Ara h 1鼠源单抗(mAb)为捕获抗体,以Ara h 1兔源多抗(pAb)为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度建立方法,并对方法的灵敏度、特异性、准确度、稳定性等检测特性进行鉴定。结果表明,双抗体夹心ELISA法的mAb和pAb最佳工作浓度分别为1∶10000稀释和1∶8000稀释;ELISA标准曲线线性范围为4~256 ng/mL,检测限为4.16 ng/mL;样品添加回收试验的平均回收率为85.9%~94.5%,且该方法与其他常见致敏蛋白无交叉反应;并能在4℃条件下避光密封保存90 d内保持检测结果稳定。说明所建立的双抗体夹心ELISA法灵敏特异、准确稳定,能够用于花生致敏蛋白Ara h 1的快速筛查。

花生过敏原Ara h 1蛋白的原核表达及致敏性分析

从花生中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到花生过敏原Ara h 1基因,构建pET-28a-Ara h 1表达载体,转入Rosetta(DE3)宿主表达菌中诱导产物表达,用镍离子亲和层析法纯化得到目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的蛋白分子质量约为75 kDa,与预计相符;经质谱鉴定为Ara h 1蛋白。用BALB/c小鼠模型评价重组Ara h 1蛋白的致敏性结果显示,重组Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特异性抗体、Th2型细胞因子、组胺含量升高,空肠和肺组织发生病变,表明重组Ara h 1蛋白可以导致小鼠发生Th2型过敏反应,且有与天然Ara h 1蛋白相似的致敏性。同时RBL细胞模型结果显示重组Ara h 1蛋白还可导致RBL细胞脱颗粒,释放β-己糖苷酶,进一步表明重组Ara h 1蛋白具有致敏性。