基于化学发光酶免疫分析法检测花生过敏原Ara h 2

Ara h 2是花生主要过敏原之一,为开发食物中Ara h 2过敏原成分的快速检测方法,减少因误食导致花生过敏事件的发生,该研究采用鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度,建立了一种检测花生过敏原Ara h 2的间接双抗夹心化学发光酶免疫分析法,并对该方法的灵敏度、准确度、精密度和特异性进行评价。该方法的检出限为1.085 ng/mL,线性范围为3.12~200 ng/mL,添加回收率为78.30%~94.39%,批内和批间变异系数均小于10%,且特异性良好,与其他常见食物过敏原无交叉反应。该方法与相同抗体所建立的间接双抗夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法相比,在灵敏度上表现出一定优势。该研究开发的化学发光酶免疫分析法可对花生食品生产过程中和消费前的Ara h 2过敏原成分检测提供可靠的技术支持。

花生过敏原Ara h2.02二级结构和B细胞抗原表位预测

为预测花生过敏原Arah2.02的二级结构和B细胞抗原表位,通过Genbank数据库搜索到Arah2.02基因,并推导出其相应的氨基酸序列,采用SOPMA和DNAStar软件预测该蛋白质的二级结构以及通过Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法分别预测其抗原指数、亲水性、表面可及性、柔韧性等参数,并综合分析预测该蛋白的B细胞抗原表位。结果表明:在序列28～31、56～73、76～90、92、148、156～158、168～169区域最可能是Arah2.02蛋白的B细胞抗原表位的优势区域。该结果将为寻找Arah2.02的最佳优势表位提供支持,同时为该蛋白单克隆抗体的制备等研究提供理论依据。

花生过敏原Ara h2.02原核表达方法条件的研究

将重组质粒pET-32a(+)-Arah2.02转化表达宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白大小约为38kDa。进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Arah2.02。为获得较多的重组蛋白Arah2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速220r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h。

DNA提取方法对实时荧光定量PCR检测花生过敏原Ara h 2基因的比较研究

食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠(Sodium Lauroyl Sarcosine)磁珠法的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生质量分数为0.05%~1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用1条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。

低致敏蛋白Ara h 1复合益生菌发酵花生乳制备工艺优化

目的:研制低致敏复合乳酸菌发酵花生乳。方法:利用试剂盒测定不同品种花生中的粗蛋白含量及Ara h 1含量,选取Ara h 1含量最低的花生品种制作发酵乳;以接菌量、接菌种类、发酵时间及糖添加量为考察因素,Ara h 1含量为测定结果,采用响应面法优化致敏蛋白Ara h 1含量下降最多的发酵花生乳制备工艺;制作复合益生菌发酵花生乳,并对产品的口感、组织状态和风味进行感官评价。结果:当接菌量为4%、接种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌、发酵4 h、糖添加量为6%时,发酵花生乳中的主要过敏原Ara h 1减少70%,含量为48μg/g,且感官评分达到80分。结论:经工艺优化获得了致敏蛋白Ara h 1含量低,凝乳效果好,口味怡人的复合益生菌发酵花生制品。

基于光谱技术分析不同还原糖对Ara h2糖基化反应的影响

糖基化反应能诱导食品中蛋白质的结构发生改变;Ara h2是花生中的主要蛋白组分之一,可以作为一种模式蛋白研究花生蛋白糖基化产物的结构变化。不同还原糖对Ara h2糖基化反应的影响目前未见相关报道。以花生蛋白Ara h2为研究对象,通过SDS-PAGE、内源荧光、同步荧光、紫外、圆二色谱、红外等光谱技术研究Ara h2糖基化前后分子量、二级、三级结构以及官能团的变化,分析六种还原糖(核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖)对花生蛋白Ara h2糖基化产物结构的影响,阐明经不同还原糖修饰后花生蛋白Ara h2的结构变化。SDS-PAGE电泳表明木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2电泳条带明显上移,糖基化程度最大;紫外光谱分析表明糖基化反应会改变花生蛋白Ara h2的吸收峰强度。五碳糖修饰的花生蛋白Ara h2具有最强的吸收强度,其中五碳糖中木糖的吸收峰强度最大;内源荧光、同步荧光和三维光谱实验结果表明,糖基化修饰会使花生蛋白Ara h2的荧光强度降低,且五碳糖修饰的Ara h2荧光强度最低。分析认为由于糖基化修饰使花生蛋白Ara h2的结构展开,导致芳香族氨基酸暴露在水环境中,从而引起荧光猝灭;圆二色谱分析表明不同还原糖修饰的Ara h2糖基化产物α-螺旋含量都增加,其中木糖修饰的α-螺旋含量最大(15.6%);红外光谱分析表明木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2的吸收峰分别从3327.41 cm^(-1)红移至3318.43和3321.09 cm^(-1),1700~1600 cm^(-1)处木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2吸收峰强度略高于其他还原糖修饰的该蛋白。不同还原糖对Ara h2糖基化反应后的糖基化产物结构的影响不同,还原糖的碳链越短、空间位阻越小,糖基化反应程度越高,对Ara h2的结构影响越大。

湿热处理对花生球蛋白Ara h 3抗原性的影响

为探究湿热处理对花生球蛋白Ara h 3抗原性的影响,采用硫酸铵分级沉淀法从花生脱脂粉中分离纯化出Ara h 3,进行不同温度、时间和质量浓度的湿热处理,通过正交试验确定最优湿热处理条件,采用间接ELISA法检测湿热处理后Ara h 3抗原性变化,测定外源荧光、游离巯基含量以及圆二色光谱,从蛋白结构的变化解释湿热处理对Ara h 3抗原性的影响。研究表明:湿热处理能够降低Ara h 3抗原性,且在质量浓度10 mg/mL、90℃处理30 min时,抗原性降至最低;湿热处理后的Ara h 3荧光强度、表面疏水性增强,三级结构发生变化;游离巯基含量增加、空间结构发生改变;α-螺旋和β-折叠含量降低,无规则卷曲含量增加,二级结构发生变化。湿热处理后Ara h 3空间结构发生改变,部分抗原表位遭到破坏或被包埋,抗原性降低。

花生致敏蛋白Ara h 3单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

以Ara h 3为免疫原免疫小鼠。选取血清效价高的小鼠再次免疫,制备出脾细胞后与骨髓瘤细胞一起进行细胞融合,得到杂交瘤细胞株,筛选阳性株制备大量单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对制备的单克隆抗体进行效价测定、敏感性测定和特异性测定。通过蛋白质免疫印迹试验进一步验证其特异性。结果表明:免疫性较好的4B2单克隆抗体经纯化后的效价为1∶5.12×10^(5)。由敏感性测定得知4B2单克隆抗体的半抑制浓度(IC_(50))为389 ng/mL,证明其具有较好的敏感性,交叉反应率小于0.5%,成功制备出纯度高、效价高、敏感性好、特异性强的Ara h 3鼠源单克隆抗体,为建立免疫学快速检测方法奠定了基础。

Study on mechanism of increased allergenicity induced by Ara h 3 from roasted peanut using bone marrow-derived dendritic cells

Little information was so far available about allergenic mechanism of the roasted peanut allergens during initial stages of allergy.The purpose of this study was to determine the influence of roasting(150℃,20 min)on biochemical and biological properties of Ara h 3,a major peanut allergen.Allergenicity of roasted peanut emulsion to mice,differences in uptakes between Ara h 3 purified from raw peanuts(named as Ara h 3-Raw)and that purified from roasted peanuts(named as Ara h 3-Roasted)by bone marrow-derived dendritic cells(BMDCs)and the implication of cell surface receptors involving in uptake,and changes in glycosylation and structure of Ara h 3 after roasting were analyzed in this study.This study suggested that roasting increased allergenicity of peanut to BALB/c mice.Maillard reaction and structural changes of Ara h 3 induced by roasting significantly altered the uptake of Ara h 3-Roasted by BMDCs,and modified Ara h 3 fate in processes involved in immunogenicity and hyper allergenicity,indicating that food processing pattern can change food allergenicity.

花生过敏原Ara h6的分离纯化及鉴定

为高效分离纯化花生过敏原Ara h 6,通过脱脂、蛋白浸提、阴离子交换层析分离得到目的蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)及免疫印迹技术(Western blotting)对其进行鉴定。结果表明,该蛋白为花生过敏原Ara h 6,其分子质量约为15kD,纯度大于95%,得率为22.5%。该方法简单、高效,可为花生过敏的进一步研究提供实验材料。

还原协同加热处理对花生过敏原Ara h2结构及抗原性的影响

花生过敏能引起荨麻疹、呕吐甚至休克等症状,通常是终生性过敏。本研究运用加热处理、半胱氨酸还原对Ara h2进行单独和复合处理,采用圆二色谱、紫外扫描光谱、间接竞争酶联免疫吸附法分别检测蛋白加工前后的结构与抗原性变化。结果显示,单一的加热和半胱氨酸还原处理过的蛋白结构与抗原性只发生部分变化。而复合处理中,在加热条件下,半胱氨酸还原蛋白的能力明显增强,还原后的蛋白二级结构与三级结构发生大幅变化,抗原性显著降低。研究结果表明,二硫键对于蛋白Ara h2结构稳定具有重要作用,二硫键被还原和加热过程破坏后,蛋白的抗原性和结构即发生重大变化。还原协同加热处理有望大幅改善2S球蛋白的结构和致敏性,可以作为蛋白脱敏加工的备选方法。

重组花生过敏原Ara h2的生物合成

为获得重组花生过敏原Ara h2。通过RT-PCR合成cDNA,并以此为模板进行PCR扩增目的基因Ara h2,扩增产物经纯化后克隆至pMD19-TSimple载体中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h2。上述重组质粒经酶切纯化后定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-Ara h2,并转化表达宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该表达蛋白大小约为46kD,与理论值相符。通过Glutathione Sepharose 4B凝胶亲和层析方法纯化融合蛋白GST-Ara h2,获得融合蛋白纯度约为90%。Western blotting分析表明,经纯化的融合蛋白能与抗Ara h2兔血清发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL(折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL),抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633(C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL),IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。

花生过敏原Ara h2与Ara h6的生物信息学比较研究

运用生物信息学技术比较Ara h2和Ara h6从一级结构到三级结构的异同．结果发现，Ara h2含有一段独有的序列（60～73），其中包括Ara h2三个主要IgE抗原表位中的两个．以Ara h6为模板进行同源建模获得了Ara h2的立体结构，与Arah6的结构叠加拟合后，该结构多出一段由蛋白环连接的反向平行β-折叠（58～72），其伸展结构同样包含上述两个IgE表位的蛋白序列．探讨从Ara h2和Ara h6的一级结构到三级结构产生免疫学活性差异的原因，为研究花生过敏机制及设计低致敏原疫苗奠定基础．

花生主要过敏原Ara h1的纯化

采用硫酸铵沉淀及凝胶过滤层析方法,纯化花生主要过敏原蛋白Ara h1,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合免疫印迹实验(Western-Blotting)进行鉴定。结果表明:可纯化出纯度90%以上的Ara h1过敏原蛋白。

花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白Ara h 8;Western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生Ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。

花生致敏原Ara h 1的重组表达与纯化

Ara h 1是花生中含量最高的过敏原,也是致敏性较高的蛋白之一。目前提纯Ara h 1的方法大多涉及2至3步柱层析,步骤繁琐且成本较高。本文中,将带有6×his标签的Ara h 1基因与pET-32a表达载体融合,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导使其表达目标蛋白。菌体裂解后使用Ni-NTA吸附、梯度洗脱对Ara h 1进行纯化。采用质谱及Western-blot鉴定纯化蛋白的种类及免疫活性。结果显示,质粒中目标基因的序列与NCBI数据库中Ara h 1的基因数据相符;300 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷22℃诱导菌液22 h时蛋白表达量最高;添加15 mmol/L十二烷基磺酸钠可将蛋白释放到上清液中,使用含50,100 mmol/L咪唑的洗脱液分别洗脱2次和1次后得到纯度较高且免疫原性良好的重组Ara h 1。

^(60)Co-γ辐照对花生过敏原Ara h 2蛋白构象及致敏活性的影响

为探讨辐照处理对花生Ara h 2蛋白结构与致敏活性的影响,采用不同剂量^(60)Co-γ辐照处理分离纯化所得到的花生过敏原Ara h 2蛋白,结合紫外扫描光谱、圆二色谱(CD)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估辐照处理后Ara h 2蛋白的结构变化,并用免疫印迹法和间接酶联免疫吸附法检测辐照处理后Ara h 2的抗原性变化。结果表明,^(60)Co-γ辐照处理可以显著改变花生Ara h 2蛋白的构象,使其降解、发生交联。随着辐照剂量的增大,Ara h 2蛋白与抗体的结合能力呈逐渐下降趋势,且与蛋白紫外吸光度的增强和α-螺旋含量的降低呈现良好的相关性。当辐照剂量为10 kGy时,可基本破坏Ara h 2蛋白的结构和免疫活性。^(60)Co-γ辐照处理可以有效降低花生过敏原Ara h 2蛋白的致敏性,这为花生脱敏技术的研究提供了新思路。

花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体的制备与应用

目的制备与鉴定抗花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体,建立双单抗ELISA法,检测食品中花生过敏原。方法以花生主要过敏原Ara h1为抗原免疫Balb/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA法和Western blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性。建立双单抗夹心ELISA法检测食品中的花生过敏原。结果共获得抗Ara h1细胞株4株,分别命名为2G9、5G4、5B5、2C7,效价均高于1∶106。经抗体亚型鉴定,4株抗体均为Ig G1型。Western blot的结果表明4株抗体均能识别Ara h1,其中2G9与5G4结合能力较强。在特异性检测实验中,2G9和5G4与其他种类过敏原无交叉反应。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现花生Ara h1蛋白的检出低限为:5 ng/ml,标准曲线在~80 ng/ml范围内线性良好。利用此法检测了10种食品,结果显示在5种含有花生成分的食品中均检测到了花生过敏原。结论获得高效价抗体4株,建立了高效、高特异性的食品中花生过敏原的检测方法,为食品中花生过敏原的检测提供了依据。

基于表位预测的花生过敏原Ara h6免疫交叉反应性研究

为了探讨花生过敏原Arah6与其他同源蛋白之间的交叉反应,通过各种生物信息数据库(Genbank,DiscoTope)以及网络工具及软件(BLAST,NPS@和Protean,Clustalx,PyMOL),开展基于表位预测的Arah6交叉免疫反应性研究。结果表明:肽段AA10～15、45～48、53～60、116～118区域可能是Arah6的线性表位优势区域;Arah6的构象型表位优势区有4个,它们存在的区域为AA1～13、35～51、53～59、89～105;基于线性表位预测的15种蛋白质与Arah6可能具有交叉反应性,其中4种(Arai6,conglutin,Arad6和conglutin8)发生交叉反应的概率为100%;基于构象型表位预测的17种蛋白质与Arah6可能具有交叉反应性,其中4种(Arai6,conglutin,Arad6和conglutin8)发生交叉反应的概率为100%。本结果对进一步了解Arah6的过敏性以及指导开展食品中Arah6的免疫学检测具有重要作用。