花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全c DNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与p MD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21(DE3)宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 k D,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。

花生过敏原Ara h6的分离纯化及鉴定

为高效分离纯化花生过敏原Ara h 6,通过脱脂、蛋白浸提、阴离子交换层析分离得到目的蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)及免疫印迹技术(Western blotting)对其进行鉴定。结果表明,该蛋白为花生过敏原Ara h 6,其分子质量约为15kD,纯度大于95%,得率为22.5%。该方法简单、高效,可为花生过敏的进一步研究提供实验材料。

基于表位预测的花生过敏原Ara h6免疫交叉反应性研究

为了探讨花生过敏原Arah6与其他同源蛋白之间的交叉反应,通过各种生物信息数据库(Genbank,DiscoTope)以及网络工具及软件(BLAST,NPS@和Protean,Clustalx,PyMOL),开展基于表位预测的Arah6交叉免疫反应性研究。结果表明:肽段AA10～15、45～48、53～60、116～118区域可能是Arah6的线性表位优势区域;Arah6的构象型表位优势区有4个,它们存在的区域为AA1～13、35～51、53～59、89～105;基于线性表位预测的15种蛋白质与Arah6可能具有交叉反应性,其中4种(Arai6,conglutin,Arad6和conglutin8)发生交叉反应的概率为100%;基于构象型表位预测的17种蛋白质与Arah6可能具有交叉反应性,其中4种(Arai6,conglutin,Arad6和conglutin8)发生交叉反应的概率为100%。本结果对进一步了解Arah6的过敏性以及指导开展食品中Arah6的免疫学检测具有重要作用。

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL(折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL),抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633(C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL),IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。

花生过敏原结构及加工研究进展

花生过敏已成为世界各地普遍存在的公众性健康问题,得到广泛关注,对花生过敏原的研究日渐深入。过敏原结构为加工降低其过敏原性提供基础,用各种加工手段降低甚至消除花生过敏原蛋白的致敏性,尤其是Ara h 1、Ara h 2和Ara h 6、Ara h 3/4这些含量高、致敏性强的主要过敏原的致敏性已备受重视。本文主要介绍花生过敏原研究在结构及加工方面的进展,以期为低致敏甚至脱敏花生的生产提供一定的参考,以保证实现丰富食物过敏患者食品选择的同时,有效降低食品安全风险。

利用连续提取法定量花生蛋白

为了建立一个数学模型,用于计算花生基质中蛋白含量,实验将花生脱脂粉进行五步连续提取,利用Bradford法和SDS-PAGE,分别定量出每次花生提取液中可提取的蛋白、花生过敏原蛋白Ara h 3/4和Ara h 6,用于分析提取量与提取次数的关系。结果显示,每次蛋白提取量可用等比数列an=a1qn-1表示,根据等比数列求和公式可计算出可提取的总蛋白量。因此,利用五步连续提取法获得的数学模型可作为一种计算花生基质中蛋白含量的方法。