多花黄精查尔酮合酶PcCHS的原核表达、亚细胞定位及表达分析

【目的】探究查尔酮合酶(chalcone synthase,PcCHS)基因在多花黄精类黄酮合成中的作用,为后续解析PcCHS功能以及多花黄精新品种选育提供可靠的理论依据。【方法】以多花黄精为cDNA模板,克隆多花黄精PcCHS基因的编码序列,对该基因进行生物信息学分析。通过构建PcCHS的原核表达载体,纯化目的重组蛋白,验证该酶的体外表达活性。利用瞬时超表达体系探究该基因过表达后总黄酮的含量变化。利用Gateway技术构建亚细胞定位载体35S::PcCHS-GFP,通过本氏烟草表达系统确定目的蛋白亚细胞定位情况。【结果】PcCHS基因的开放阅读框为1 251 bp,理论分子量为44.63 kD,等电点为5.89,属于亲水蛋白,与石刁柏(Asparagus officinalis)CHS亲缘关系较近。原核表达实验表明,pET28a-PcCHS经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达可溶性重组蛋白,Western-blot显示大小约为45 kD,与预期大小一致,且纯化的目的蛋白具有一定的酶活性,能催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化为柚皮素查尔酮。此外,PcCHS瞬时超表达中,PcCHS组的表达量显著高于空载K组,总黄酮含量也显著高于空载K组,最高可达1.83倍。亚细胞定位结果显示,该基因在细胞膜和细胞核中发挥作用。【结论】PcCHS基因原核表达的酶具有体外酶活性,其亚细胞定位于细胞膜和细胞核,且瞬时超表达能够显著提高多花黄精叶片总黄酮含量。

阿拉伯糖苷酶基因的克隆、表达及表达产物的酶稳定性

阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶是木聚糖类半纤维素生物降解和转化所必需的酶类。本文在国内首次报道对该酶的研究 :通过PCR从产乙醇热厌氧杆菌ThermoanaerobacterethanolicusJW2 0 0克隆出编码高度热稳定性阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因 ,与组氨酸标签融合 ,以高拷贝质粒pAlter Ex1在大肠杆菌中得到高效表达 ;基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,得到的阿拉伯呋喃糖苷酶在pH4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,75℃的半衰期为 1h ;β 木糖苷酶在pH 5 .0～ 8.2之间有较高的稳定性 ,酶 1h半衰期温度为 84℃。

大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因克隆与表达研究

根据同源性设计引物,通过RT-PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因,并由此推测出其相应的氨基酸序列.将该基因克隆到表达载体pPIC9K中,经电激转化后整合至毕氏酵母细胞中获得表达.该表达产物经两步柱层析后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,获得单一条带,并表现较强的生色底物活性.

豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

将含有和不含前肽的豆豉溶栓酶编码序列在毕赤酵母中分别进行表达研究,发现在含有前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母工程菌用甲醇诱导时,其培养液中可检测到较强的溶栓酶活性;而在不含前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母菌用甲醇诱导时,培养液中未检测到溶栓酶活性.对毕赤酵母表达和分泌的豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对其纯化产物进行溶栓酶活性、SDS-PAGE电泳、抑制剂作用及免疫印迹分析.结果表明,分泌到培养液中的豆豉溶栓酶已经过剪切加工,其前肽已被切除,重组与天然的豆豉溶栓酶具有相同的溶栓酶活性,其所测定的各理化指标均一致.本研究实现了豆豉溶栓酶在毕赤酵母菌中成功表达,并首次直接证明了前肽对豆豉溶栓酶在毕赤酵母中分泌表达是必须的.

极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究

采用PCR从海栖热袍菌 (Thermotogamaritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因 ,以pET 2 0b为表达质粒 ,与其C末端 6个组氨酸标签序列融合 ,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为 90～ 95℃和pH 5 .0～ 5 .5 ,在pH 4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,95℃的半衰期为 4h ;SDS PAGE测得酶的分子量为 5 6 .5 7kD ,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中 ,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯 阿拉伯呋喃糖苷 (pNPAF)有专一性水解作用 ,其动力学参数Km 值为 0 18mmol L ,Vmax为 139μmol min·mg。

牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

经DNAstar分析,据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因序列设计合成gB基因的特异性引物,以构建的pGM-T-gB为模板,PCR扩增IBRV gB蛋白192-266位氨基酸的基因序列。将目的片段克隆,酶切鉴定并测序鉴定后,定向插入pET32a表达载体中,转化表达菌BL21。SDS-PAGE电泳分析表明,诱导表达产物以包涵体和可溶形式存在,大小约为29.2 ku,与预测值相符。亲和纯化后重组蛋白浓度为2.000 mg/mL,纯度为79.2%。间接ELISA检测证明,表达蛋白具有抗原性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为50μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,阳性标准定为S/P>0.395。交叉试验表明对牛流热(BEV)、牛肺疫(CBPP)、牛病毒性腹泻(BVD)、牛结核(BTB)、牛副结核(PBB)以及牛赤羽病(BAD)等其它6种疾病阳性血清不发生交叉反应。与中和试验相比较,特异性、敏感性和符合率分别为83.3%、90.9%和88.9%;与进口法国IBRV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为92%、92.7%和92.5%。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性,显示了良好的应用前景。

蚯蚓纤溶酶基因P_(239)的原核表达、纯化及活性测定

通过RT PCR方法从蚯蚓 (Lumbricusbimastus)中获得蚯蚓纤溶酶基因 ,命名为P2 3 9,含有 85 2个核苷酸 ,成熟肽编码 2 3 9个氨基酸 ,通过Genbank序列同源性比较 ,与已知的蚯蚓纤溶酶有一定的同源性 ,为首次获得的新基因。随后构建了 pBV2 2 0 /P2 3 9重组质粒 ,在大肠杆菌DH5α中进行原核表达 ,再经亲和层析柱纯化复性 ,其产物经活性测定 ,确定不仅具有激酶作用 ,而且具有直接溶栓活性。

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用表达载体pET-30a，实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd及未突变的高温”淀粉酶基因amy在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。经多步纯化，重组酶AMY及AMYD的比活分别达到312．7U／mg蛋白和354．6U／mg蛋白，纯化倍数分别为75．90和83．83，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经SDS-PAGE检测，AMY及AMYD酶分子质量均为63．5ku。重组酶AMY的最适温度80℃，最适反应pH为6．5，在温度低于90℃，反应pH5．5～7时，酶活较稳定。重组酶AMYD的最适温度80℃，最适反应pH为4．5，在温度低于90℃，反应pH4．0～6．5时，酶活较稳定。

家蚕孵化酶样基因BmHEL的原核表达及蛋白纯化与功能鉴定

孵化酶(hatchingenzyme,HE)是后生动物卵孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。在已完成全长967bp的家蚕孵化酶样基因(BmHEL)克隆及其转录特性分析的基础上,研究了该基因在原核表达系统的表达、产物纯化及其对家蚕卵壳的降解功能。以全长BmHEL质粒DNA为模板,用PCR方法分别获得了该基因的开放阅读框(BmHELORF,885bp)、缺失信号肽编码区(BmHELa,834bp)和推测成熟酶功能编码区(BmHELb,624bp)的3个片段,并亚克隆入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行表达。表达的3种外源蛋白均以包涵体形式存在,获得含有6×His-Tag标签的融合蛋白,其分子质量分别为33.4、31.8、24.0kD。通过Westernblot方法检测到了用Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白。纯化复性后的3种孵化酶对家蚕卵壳底物有一定降解活性,其中BmHELORF的活性最高,BmHELb的活性最低。在pH7.1反应条件下3种酶的活性比pH9.5时高。研究结果在蛋白质水平上进一步证实家蚕孵化酶样蛋白参与了蚕卵孵化这一重要生命过程。

蝶蛹金小蜂热激蛋白家族基因表达与热保护功能

作为分子伴侣,热激蛋白可起修复变性蛋白与阻止其他蛋白质聚集的作用。为进一步理解蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum热激蛋白家族的分子伴侣功能,本研究对来自该寄生蜂的热激蛋白Pphsp90,Pphsp70,Pphsc70,Pphsp60,Pphsp40和Pphsp20的基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株中进行了过表达。结果表明:除Pphsp40外,其余5个基因均得到高效表达,且表达的重组热激蛋白在高温下(80℃)具可溶性与热稳定性。其中,Pphsp20与Pphsp90在大肠杆菌中的表达显著提高了高温下(50℃,1h)细胞的存活率。离体活性实验证实,利用纯化的融合蛋白Pphsp20可减少高温下荧光素酶的聚集现象。据此认为,Pphsp20与Pphsp90均具有大肠杆菌细胞的热保护功能,但Pphsp20可以单独发挥作用,而Pphsp90可能需其他因子协同作用才有保护活性。

甲醇芽孢杆菌凝乳酶的重组表达及其结构特性

为进一步了解微生物凝乳酶的结构特性,根据GenBank数据库中甲醇芽孢杆菌凝乳酶(I3EB99)的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成此凝乳酶的全基因序列,构建原核表达载体,通过BL21(DE3)表达其融合蛋白,将获得的融合蛋白进行His标签特异性亲和纯化,并利用生物信息学方法研究凝乳酶的三维空间立体结构。结果表明,重组表达的甲醇芽孢杆菌凝乳酶质量浓度为0.7 mg/mL,凝乳活力为(15870±1.17)SU/g,蛋白水解活力为(263.81±0.94)U/g,凝乳活力与蛋白水解活力比值为60.16,符合干酪生产加工的要求。结构特性研究表明,经重组表达后的甲醇芽孢杆菌凝乳酶呈现疏水特性,具有跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋少于β-折叠,在分离纯化过程中结构不稳定易降解,该凝乳酶与来自甲醇芽孢杆菌的一种未知蛋白酶是同源蛋白,高级结构与PDB蛋白数据库中的模板蛋白2ra1.1.A相似度最高。通过对甲醇芽孢杆菌凝乳酶结构特性的研究,为深入分析该凝乳酶作用机理及其功能性奠定了理论基础。

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因的异源表达及纯化

将去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a上，实现重组质粒pET-amyd在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析，重组酶AMYD的比活达到354．6U·mg^-1、纯化倍数为83．83，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经SDS-PAGE检测，AMYD酶分子量为63．5kDa。重组酶AMYD的最适温度80℃、最适反应pH值为4．5，在温度低于90℃、反应pH值4．0～6．5的条件下，酶活较稳定。

黄孢原毛平革菌漆酶基因lac1680的克隆、表达及产酶研究

以先前筛选到的高产漆酶黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)为模板,利用同源克隆技术合成一个全长为1 680 bp的漆酶基因,核苷酸及氨基酸序列比对显示该基因与真菌漆酶基因有较高的同源性,将其命名为lac1680,将该基因连接到构建好的p ET24a载体上,并转入表达菌株BL21 Escherichia coli(DE3)中,经对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测,获得75 k D目的条带,表明诱导表达成功。随后利用NI-NTA层析柱对洗脱下来的lac1680蛋白进行纯化,纯化回收后,漆酶纯度可达98%以上。通过对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌野生菌株不同培养时间产酶活力,结果表明构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了近39%。

20～100目膨化黑米粉的控制性粉碎研究

在粉碎膨化黑米的过程中,为了得到20~100目这一特定粒度段的膨化黑米粉,试验采用自制的叶轮式粉碎机在干法状态下研究膨化黑米的控制性粉碎。考察了在改变筛笼与叶轮间隙、粉碎主机转速、引风机流量及筛笼孔径的情况下对粉体产量、20目以上的粗粉在试验产品中的质量占比(η1)、20~100目粉体在试验产品中的质量占比(η2)的变化规律。结果表明:筛笼与叶轮间隙为8 mm时,产量和η2比5 mm时高;随着粉碎主机转速从864 r/min增大到1 152 r/min及引风机流量从868 m3/h增大到1 409 m3/h时,产量不断提高,η2不断减小;筛笼孔径为10 mm时,产量和η2比5 mm和8 mm时高。在筛笼孔径改变的情况下,η1会大幅度变化。筛笼与叶轮间隙为8 mm、粉碎主机转速为864 r/min、引风机流量为868 m3/h及筛笼孔径10 mm时,η2最大。

有机磷降解酶基因(opdA)在大肠杆菌中高效表达的研究

合成opdA基因,构建表达载体pET-28b-opdA,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中得到重组工程菌株,并对重组菌株的诱导表达条件进行优化。结果表明:诱导前菌液OD_(600)的吸光值为0.5,IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为5 h。opdA酶对甲基对硫磷的K_m为42.6μmol/L,其ν_max为32.669μmol/(L·min),比酶活为24.48U/mg。

玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表达及其降解毒素初步研究

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由镰刀菌属产生的次生代谢物,是极易污染粮食作物的真菌毒素之一。ZEN具有强烈的雌激素样效应及致癌性,给人类和动物的健康造成巨大威胁。本研究在NCBI数据库中进行同源比对,获得了一些ZHD101降解酶的同源基因,其中,1个来源于真菌——杨盘二孢菌(Marssonina brunnea)的蛋白序列与ZHD101具有32%的同源性,基因大小为861 bp。通过化学合成方法得到该全长基因,通过构建E.coli原核表达系统进行蛋白表达,蛋白经亲和色谱纯化后对ZEN分子进行降解活性验证,HPLC结果表明,该蛋白在6 h内对10μg ZEN分子的降解率为98%,酶活为200 U/m L,从而获得了1个新的ZEN降解酶基因。

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶的体外定点突变及其活性鉴定

【目的】研究家蚕Bombyx mori磷酸吡哆醇氧化酶(pyridoxine5'-phosphate oxidase,PNPO)个别保守氨基酸残基对PNPO酶活性的影响。【方法】用重叠延伸法把氨基酸残基Lys111(AAA)突变为Glu(GAA),Ser160(AGC)定点突变为Ala(GCC);构建重组表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达,经亲和纯化后进行酶活鉴定。【结果】重组蛋白的分子量约为45.0kDa。体外酶活分析发现,家蚕氨基酸残基Lys111突变体K111E活性降低了约78.0%,Ser160突变体S160A的活性降低了67.4%。【结论】结果提示氨基酸残基Lys111和Ser160对维持家蚕PNPO的酶活性有重要作用。本研究明确了家蚕磷酸吡哆醇氧化酶个别保守氨基酸残基的酶学功能。

nsp7的原核表达、纯化与免疫原性鉴定

目的获得高纯度和高免疫原性的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒非结构蛋白7(nsp7)。方法 nsp7编码DNA片段是PRRS病毒基因组裂解产物,酶切后连接至克隆质粒pET-28a构建为表达质粒pET-28a-nsp7,转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导蛋白表达,采用Ni2+-NTA树脂纯化、Q阴离子交换层析、镍柱浓缩3个连续的过程进行纯化和用SDS-PAGE、Western blot、ELISA法进行鉴定。在此基础上通过间接ELISA法对135份血清样品进行检测,并与进口LSI-ELISA试剂盒进行比较。结果 SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量约为34×103,与理论值相一致;该蛋白产量高、可溶性好,纯度达95%;Western blot和间接ELISA法鉴定结果显示该重组蛋白能够与PRRS病毒的阳性血清反应,与进口LSI-ELISA试剂盒相比其符合率达91%。结论成功构建了nsp7蛋白的表达与纯化系统,获得了高纯度和高免疫原性的nsp7蛋白,为PRRS血清学诊断奠定了基础。

家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin15的克隆表达及重组蛋白的体外活性分析

为探明家蝇重组Serpin15蛋白的体外活性和酶稳定性,本文对家蝇Serpin15基因进行了生物信息学分析和克隆表达,并对纯化后的家蝇重组Serpin15蛋白进行了酶特性的研究。结果显示:家蝇Serpin15基因ORF框全长为1353 bp,编码450个氨基酸,理论分子量为51076.63 Da,有信号肽和一个标志抑制活性的功能结构域RCL反应环;成功构建原核表达载体pET-28a(+)-Serpin15,经诱导表达和纯化获得家蝇重组Serpin15蛋白;重组蛋白酶特性研究发现,家蝇重组Serpin15蛋白对胰蛋白酶有极显著的抑制作用,此外,将重组Serpin15蛋白经20~60℃热处理15 min,或经pH 6~10过夜处理,或经50℃和pH 8处理后室温存放15~90 min,重组蛋白的胰蛋白酶抑制活性均仍大于70%。研究结果为家蝇Serpin15蛋白的免疫功能研究奠定了重要实验基础,也为有害昆虫杀虫剂的研发提供思路。

人USP14蛋白在大肠杆菌中表达纯化的初步研究

采用PCR技术从人胎脑cDNA文库中克隆了usp14(ubiquitin-specific peptidase 14)基因编码区全长序列。序列分析表明人usp14基因含有peptidase蛋白酶C19A保守区,将usp14基因与pET-28b(+)载体相连,构建表达载体pET28b/usp14;把该表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)pLyS,以Isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导25°C 6小时,USP14蛋白获得高效表达。对表达产物进行Western blotting检测,并用Ni-NTA亲和层析技术获得了纯化的人USP14蛋白,表达的目的蛋白大小约为56kDa。