天冬氨酸116在光驱质子泵古紫质-4中的作用研究

古紫质-4(archaerhodopsin-4,aR4)是一种存在于嗜盐菌(Halobacterium sp.)XZ515细胞膜上含有类胡萝卜素发色团的细菌类光敏受体蛋白,与细菌视紫红质(bacteriorhodopsin,bR)具有类似的三聚结构和光驱质子泵功能。已有研究表明,bR蛋白D螺旋上具有保守性的天冬氨酸115(aspartic acid 115,D115)的去质子化会影响其质子泵功能,但其等位残基D116在aR4中的作用尚未见报道,特别是与D螺旋存在相互作用的类胡萝卜素发色团是否会对其功能存在影响更不得而知。本研究通过基因定点突变技术将aR4中的D116突变为极性不同的N116和A116以及bR的等位突变,采用紫外-可见光吸收光谱、闪光光解光谱和酸碱滴定等方法对比研究D115/D116突变对bR和aR4结构及光循环动力学的影响。研究结果表明,D116在aR4中的作用与D115在bR中的作用有所不同,且受类胡萝卜素发色团菌红素的影响。本研究有助于进一步认识含类胡萝卜素发色团的光敏受体蛋白D螺旋和菌红素的作用,同时也为研究其他双发色团微生物视紫红质家族蛋白的结构功能提供依据。

类胡萝卜素发色团对光驱质子泵aR4关键残基F146功能的影响

古紫质-4(archaerhodopsin-4,aR4)是一种类似于细菌视紫红质(bacterirhodopsin,bR)的光驱质子泵蛋白,同样具有三聚结构。其差异性在于,每个单体除了由一分子视蛋白和一分子视黄醛发色团共价结合而成外,单体间还镶嵌有一个类胡萝卜素发色团菌红素(bacterioruberin),同时二者具有不同的质子传输时序。苯丙氨酸-146(phenylalanine-146,F146)和甲硫氨酸-145(methionine-145,M145)是aR4和bR视黄醛键合区处在相同位置且唯一不同的关键残基。已有研究结果表明,bR的M145F突变可影响其暗适应态下视黄醛的顺反异构平衡,而且对其光循环有着重要的影响。然而,F146在aR4中的作用尚不清楚,特别是菌红素对质子泵视黄醛键合区关键残基的作用是否存在调控尚未见报道。为此,本研究采用定点突变技术、原位紫外-可见光吸收光谱、闪光动力学光谱、酸碱滴定和固体核磁共振等技术手段,对比分析F146M和M145F单点突变对aR4和bR视黄醛键合区和光循环影响的共性和差异性。研究结果表明,F146和M145在aR4和bR中均起到维持视黄醛顺反异构平衡的作用,突变可造成键合区装配紧密程度和胞外侧氢键网络的改变,从而参与调控质子释放至胞外的过程。此外,本研究发现菌红素不仅具有稳定aR4三聚结构的作用,更重要的是对键合区关键残基F146存在调控作用,菌红素的缺失可造成F146作用的弱化。

D97N突变对光受体蛋白古紫质4质子泵和能量转换效率的影响

古紫质4(archaerhodopsin 4,aR4)是新近发现的古生菌Halobacterium species xz515红膜上唯一的光敏视黄醛蛋白,具有和细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)相似的质子泵功能,但在中性p H条件下,其质子释放和摄取顺序与bR相反。针对质子供体天冬氨酸97(Aspartic acid 97,D97)对aR4光循环;特别是对质子释放摄取顺序和菌株ATP生成率的影响,采用基因定点突变技术,构建了aR4的单突变体D97N,以及相对应的bR单突变体D96N。采用紫外-可见吸收光谱和闪光动力学光谱技术初步研究突变对视黄醛键合区、光反应中间态M态和O态、质子泵功能以及菌株ATP生成率的影响。结果表明,D97N突变对视黄醛紫外-可见光吸收波长没有太大影响,但造成M态衰减时间的显著延长、质子泵功能的消失及菌株ATP的生成率大幅降低。与bR中的D96作用相比,D97对aR4质子功能的影响有所不同,这可能与D97所处的一个更为疏水性的胞外侧环境有关。

精氨酸82和精氨酸83在光驱质子泵细菌视紫红质和古紫质-4中的功能对比研究

古紫质-4(Archaerhodopsin-4,aR4)是一种存在于嗜盐菌Halobacterium species XZ515细胞膜上含有类胡萝卜素发色团菌红素(Bacterioruberin)的光敏受体蛋白,与细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)具有相似的三聚结构和光驱质子泵功能。尽管二者均为外向质子泵,但aR4表现为与bR不同的先摄取后释放的质子传输时序。位于bR胞外半通道的精氨酸82(Arginine 82,R82)充当着视黄醛键合区五边形氢键网络与质子释放簇(proton release cluster,PRC)之间的桥梁,不仅向胞外传递D85的质子化信息,同时调控PRC质子的释放和再质子化。R83作为aR4中的同源等位残基,其侧链取向与bR中的R82有所不同,而这一差异是否与其质子释放时序的不同有关目前尚未见报道。为此,本研究采用定点突变技术、原位紫外-可见光吸收光谱、闪光动力学光谱、酸碱滴定等技术手段,对比分析R83和R82在aR4和bR中的差异性作用。研究表明,R83和R82在aR4和bR中均起到质子受体与质子释放簇之间的“桥梁”作用,但是R83与PRC间的氢键相互作用要弱于R82与PRC间的氢键相互作用,这可能是导致aR4不同质子释放时序的原因之一。此外,菌红素的缺失可导致R83功能对体系pH依赖性增加。

M145F/F146M突变对光受体蛋白细菌视紫红质和古紫质4光循环的影响

古紫质4(archaerhodopsin 4,aR4)与细菌视紫质(bacteriorhodopsin,bR)同属于盐杆菌科,同源性59%,均为光驱质子泵。其功能是在光照条件下将质子由胞内泵到胞外形成跨膜质子梯度,该梯度差被膜上另外一种蛋白ATP合成酶用于ATP的合成,从而完成光能向生物能的转化。aR4和bR具有相似的光循环过程,但质子传递时序不同,aR4是先从胞内吸收质子再将质子释放到胞外,而bR恰好相反。甲硫氨酸-145是位于bR视黄醛发色团键合区的一个重要残基,对其光循环有着重要的影响,而在aR4中处在相应位置上的苯丙氨酸-146是其视黄醛键合区与bR唯一不相同的残基。因此通过定点突变,采用紫外可见吸收光谱、动力学光谱、质子泵功能检测、低温透射红外光谱等手段对比分析研究M145F和F146M单点突变对bR和aR4光循环造成的影响,有助于深入理解aR4结构与功能的关系。研究结果表明,M145F突变造成了bR光循环L的丢失和质子泵功能的减弱,而F146M突变并未对aR4的光循环造成显著影响,且突变后aR4质子释放时序没有反转,表明该位置上的残基在两个体系中的作用不尽相同。

Y186F突变对光受体蛋白古紫质-4质子传输和能量转换的影响

光驱动质子泵是一类以视黄醛为主要发色团的七-跨膜光敏受体蛋白,其功能是利用质子由胞内输送到胞外所形成的氢离子浓度梯度,通过ATP的合成将光能转化为化学能。本研究以细菌古紫质-4（archaerhodopsin-4,aR4）为研究对象,旨在探究位于视黄醛结合口袋的芳香性残基酪氨酸186（Y186）对其质子泵功能以及能量转换效率的影响。利用重叠延伸PCR技术构建Y186F^L33-aR4突变体,并通过紫外-可见光吸收光谱、动力学瞬态吸收光谱以及ATP生成率测定等手段,对RC^L33-aR4（recombinant aR4）和Y186F^L33-aR4突变体进行对比研究。研究表明,相较于RC^L33-aR4,Y186F^L33-aR4突变体的紫外-可见光谱最大吸收峰发生了4 nm的蓝移,M中间态寿命延长了约5倍,O中间态寿命则延长了约2倍,同时突变之后造成了质子泵功能的明显减弱。此外,相较于重组RC^L33-aR4菌株,Y186F^L33-aR4突变体菌株的ATP生成率约降低了36.5%。因此可以判定。