原核Argonaute的应用研究进展

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬菌体感染。pAgos作为一类新兴的可编程核酸酶,比目前应用最为广泛的CRISPR-Cas系统更具灵活性,在生物技术方面展现出巨大的潜力。早期的研究聚焦于嗜热的pAgo,目前基于嗜热pAgos的主要应用包括分子诊断和体外DNA组装。为了推进基于Ago的体内生物技术,如基因编辑的应用,研究人员的焦点逐渐转移到中温生物来源的pAgos,虽然目前pAgos还未实现基因组编辑,但是随着越来越多的pAgo被发掘以及研究人员对pAgos催化机制的深入研究,有望开发基于pAgos的下一代基因编辑技术。本文总结了已知代表性pAgos和基于pAgos发展的生物技术,并简要分析了pAgos在原核生物和真核生物体内应用面临的挑战和可能的应对策略。

Argonaute蛋白与心血管疾病关系的研究进展

Argonaute(AGO)蛋白是一种高度保守的蛋白,可与小分子RNA构成RNA诱导沉默复合物(RISC),而RISC可靶向与小分子RNAs互补的靶信使RNA,并通过RNA降解、翻译抑制或染色质修饰等途径调控基因表达,从而参与生理病理过程。既往关于AGO蛋白的研究主要集中于其在肿瘤疾病发生发展中的作用,近年则着重于AGO蛋白的组织分布特点、复合体结合能力和靶向沉默基因的能力在糖尿病心肌病、心力衰竭、心房颤动等心血管疾病(CVD)发生发展中的作用。AGO蛋白在CVD中的作用机制已成为目前研究的热点,深入探究其具体的分子调节机制有望为CVD的诊疗提供新靶点。

新型Argonaute蛋白的挖掘及体外活性表征

本研究旨在挖掘新的具有可编码核酸切割活性的Argonaute(Ago)核酸酶。利用已报道的Ago核酸酶的氨基酸序列在NCBI中进行序列比对获得同源性较高的新型Ago蛋白作为候选蛋白;以大肠杆菌为异源表达系统,对候选蛋白的基因进行密码子优化;表达后的目的蛋白利用亲和层析进行分离和纯化;设计核酸定向切割体系以测试纯化蛋白的可编码核酸酶活性。结果显示,序列比对共获得4个候选Ago蛋白,均可在大肠杆菌中可溶表达,再通过亲和层析得到了高纯度的目的蛋白;纯化后的4个候选Ago蛋白经测试均具有可编码核酸内切酶活性。本研究建立的Ago核酸酶的挖掘和体外活性表征的方法,可高效获取新型Ago,对于后继Ago核酸酶的研究工作具有借鉴和参考价值。

猕猴桃DCL、RDR和AGO基因家族的鉴定与分析

为研究猕猴桃RNAi抗病毒机制相关基因DCL、RDR和AGO。本研究采用blastp比对法和NPS@、SignalP-5.0及TMHMM 2.0等数据库对猕猴桃RNAi相关蛋白家族进行鉴定及其对应基础性质(如:亚细胞定位、二级结构等)的分析。结果在猕猴桃中共鉴定获得4个DCL、6个RDR和18个AGO基因,其中19个基因分布在13条染色体(即第3、6、9、12、13、16、17、18、19、23、26、27、29号染色体)上,另外9个基因未定位到染色体具体位置。AcAGO1d、AcAGO2a、AcAGO2b、AcAGO2d基因在19号染色体成簇存在。RDR基因和AGO2/7基因包含的内含子较少,其他的AGO和DCL基因包含的内含子较为丰富。这些猕猴桃基因均与番茄更近缘,它们编码的蛋白质含有不同比例的二级结构类型,无规则卷曲占50%左右,其次是α-螺旋和β-折叠。本研究完善了猕猴桃DCL、RDR和AGO编码基因的鉴定,后分析其对应的基础性质,以期为猕猴桃抗病毒研究奠定基础。

神经胶质调节平行记忆形成雪旺细胞中Argonaute 2的消融加速糖尿病周围神经病变的进展

施万细胞(SCs)形成髓鞘并为轴突提供代谢支持,这对于正常的神经功能至关重要。鉴定出特定于SCs和神经纤维的关键分子可能为糖尿病周围神经病变(DPN)提供新的治疗目标。Argonaute2(Ago2)是介导miRNA-guided mRNA剪切和miRNA稳定性的关键分子。我们发现,在小鼠的蛋白脂蛋白(PLP)谱系SCs中敲除Ago2(Ago2-KO)导致神经传导速度显著降低、热和机械敏感性受损。组织病理学数据显示,Ago2-KO显著诱导脱髓鞘和神经变性。当DPN在野生型和Ago2-KO小鼠中被诱导时,与野生型小鼠相比,Ago2-KO小鼠的髓鞘厚度进一步减少,并加剧了神经学表现。对Ago2免疫沉淀复合物进行深度测序分析显示,在Ago2-KO小鼠中失调的miR-206与线粒体功能高度相关。体外研究数据表明,抑制miR-200诱导了SCs中的线粒体功能障碍和细胞凋亡。总之,我们的数据表明,SCs中的Ago2对于维持外周神经功能至关重要,而在外周神经病变中去除Ago2会加剧SCs功能障碍和神经元变性。这些发现为DPN的分子机制提供了新的见解。

RNA农药的研究现状和发展前景

基因干扰(RNAi)是一种在动物、植物和微生物中高度保守的基因表达调控工具。1998年,Fire等首次在秀丽隐杆线虫中证明了触发基因沉默的关键因子是双链RNA(dsRNA),而非单链RNA。具体而言,dsRNA被Dicer-like蛋白随机剪切成长度为21~24nt的小RNA(siRNA或miRNA),siRNA与Argonaute蛋白(AGOs)结合形成RNA诱导的沉默复合体(RISCs),该复合体与目标RNA链互补,诱导mRNA降解或抑制翻译进程。

杨树ARGONAUTE基因的克隆及序列分析

作为RNA诱导沉默复合体的核心元件,Argonaute(AGO)蛋白在植物生长发育过程中发挥着重要作用。以欧美杨和美洲黑杨不定根cDNA为模板,采用RT-PCR技术分离得到PeAGO5和PdAGO5基因的cDNA克隆,测序和序列分析结果表明2个目的cDNA片段均为2809bp,基因内部含有完整的开放阅读框,可编码907个氨基酸,预测蛋白质分子量分别为102.31ku和102.34ku,理论等电点(pI)分别为9.34和9.7。所推导的2个氨基酸序列之间仅有7个差异位点,含有3个保守的结构域,DUF1785、PAZ和Piwi结构域。它们与拟南芥AtAGO5蛋白的相似性分别为64.8%和64.3%,故将其命名为PeAGO5和PdAGO5。系统进化分析发现,PeAGO5和PdAGO5,与拟南芥AtAGO1,AtAGO5和AtAGO10蛋白同属一个进化分支。此外,采用实时定量PCR技术检测PeAGO5基因在杨树硬枝插穗不定根发育过程中的表达模式,推测该基因参与不定根发育调控。

RNA诱导沉默复合体中的生物大分子及其装配

在RNA干扰机制中,双链RNA诱导同源RNA降解的过程依赖于RNA诱导沉默复合体(RISC)的活性。RISC由Dicer酶,Argonaute蛋白,siRNA等多种生物大分子装配而成,对这些大分子的结构和功能进行深入细致的研究,有助于进一步了解RISC的形成过程、作用方式,以及阐明整个RNAi过程的作用机制。研究表明,RISC中的Dicer具有RNaseIII结构域,在RNAi的起始阶段负责催化siRNA的产生,在RISC装配过程中起稳定RISC中间体结构和功能的作用;Argonaute蛋白是RISC中的核心蛋白,有PAZ和PIWI两个主要的结构域,前者为siRNA的传递提供结合位点,后者是RISC中的酶切割活性中心;siRNA是RISC完成特异性切割作用的向导,在成熟的RISC中虽然只包含siRNA的一条链,但siRNA在RISC形成过程中的双链结构是保证RNAi效应的决定因素。尽管RISC中还存在其他一些功能未知的蛋白质,但在RISC组分结构及功能研究方面取得的进展为建立一个可能的RISC装配模型提供了理论基础。

RNAi及沉默通路调控研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的细胞内双链mRNA特异性降解的现象,属于转录后的基因沉默机制。迄今为止,RNAi已经是一种广泛应用于研究基因功能的最新和最有效的方法,并且在治疗人类和动物疾病中也有很大潜力。作者主要综述了RNAi的过程、小RNA的生物发生学及沉默通路的保护和调控。

RNAi机器

小分子非编码RNA,以不同于蛋白质调控因子的全新方式,通过RNA干扰(RNAi),调控mRNA稳定性、蛋白质合成、染色质的组织和基因组的结构.由于可方便地施加和释放控制,RNAi已被广泛作为通过沉默作用研究基因功能的手段,并正在被应用于一些重大疾病的诊治.小分子RNA沉默作用的发挥依赖于一个由多种蛋白质因子组成的RNAi机器.在过去的几年中,对RNAi机器中重要蛋白质因子的结构功能,及它们在小向导RNA指导下沉默基因表达的分子机制等方面的研究都取得了诸多突破性的进展.

兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布。方法合成特异性PIWIL4多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行PIWIL4的免疫组化研究。结果通过构建PIWIL4多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体,经ELISA及Western blot证实兔抗人PIWIL4抗体可特异性识别PIWIL4多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在BU部分正常组织和肿瘤组织中呈阳性染色。结论本项研究成功制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,为进一步研究PIWIL4在人类疾病中的意义提供了有利工具。

RNAi作用机制及应用研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由小非编码RNA(small non-coding RNA,snc RNA)诱发的基因沉默现象,广泛存在于真核生物中。RNAi现象自发现以来,很快成为生物学研究的热点,并取得了一定成果。就RNAi的作用机制、作用过程的关键因子及其应用的研究进展进行综述,以期为RNAi的进一步研究提供参考。

苹果树腐烂病菌Argonaute基因鉴定及功能初步分析

Argonaute(AGO)蛋白作为沉默复合体RISC的重要组成部分,直接影响小RNA分子的调控功能。为了明确苹果树腐烂病菌(Valsa mali)AGO蛋白的生物学功能,以揭示苹果树腐烂病菌小RNA分子作用机制奠定基础。本研究从苹果树腐烂病菌基因组中比对出2个AGO蛋白的编码基因VMAGO1和VMAGO3,序列分析发现其均具有Argonaute的标志性功能结构域PAZ和PIWI,并与粗糙脉孢菌和构巢曲霉的AGO蛋白具有高度的同源性。基于同源重组原理成功获得了VMAGO1和VMAGO3的基因单缺失突变体,其菌落、菌丝形态及菌落生长速率与野生型03-8相比没有明显变化。此外,VMAGO1和VMAGO3的缺失不影响病菌对盐离子胁迫的响应,而VMAGO3能够参与病菌对pH、H2O2胁迫的响应,且VMAGO3的缺失能够影响病菌的致病力,其具体调控机理还需进一步验证。

RNA干扰机制研究进展

RNAi是多种生物体内由dsRNA介导的同源mRNA降解现象。这是一个高度特异化的过程,涉及多种蛋白质的共同参与。在这一过程中,siRNA的结构影响其两条链装配到RISC中去的能力。除了与RISC结合外,siRNA还引导了RITS复合物结合到同源染色质,介导异染色质化过程。干扰效应的扩散,即系统性沉默可能依赖于跨膜蛋白的转运,并且很可能是在多因素调控下完成的。

短管赤眼蜂Argonaute蛋白基因家族鉴定及表达分析

动物和植物Argonaute蛋白在RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用。本研究采用生物信息学方法在全基因组水平鉴定短管赤眼蜂Argonaute蛋白基因家族,鉴定并命名6个TpAGO蛋白。蛋白结构及系统进化分析将TpAGO家族蛋白分为PIWI和Ago两个亚家族。TpAGO蛋白二级结构的数量比例差异不大,分布却存在一定差异,其中α-螺旋分布差异尤为显著。TpAGO蛋白基因结构表现明显的多样性,基因外显子数量差异明显,从1到20个数量不等;Ka/Ks分析表明TpAGO2和TpAGO5,TpAGO3和TpAGO4两对基因间进化动力为正选择作用,其他组合间表现为纯化选择。EST表达分析发现TpAGO基因在昆虫的卵期、幼虫期、蛹期和成虫期均有不同程度的表达,而且靶向EST在同一物种中具有单一性别(雌性或雄性)表达特性,表明短管赤眼蜂TpAGO蛋白基因可参与赤眼蜂性别及发育调控。该研究不仅有助于揭示赤眼蜂产雌孤雌生殖的表观遗传机理,也有助于推动赤眼蜂等天敌的生防应用。

RNA干扰与siRNA(小干扰RNA)研究进展

RNA干扰作为后基因组时代的一种下调基因表达的工具已被广泛用于基因功能的研究以及疾病的治疗。在RNA干扰技术下调基因表达的背后存在着一个复杂的蛋白质网络参与了这一功能的实现。本文对近年来RNA干扰在疾病治疗方面的进展及其机制研究方面的进展作了一些概述。

PIWI和肿瘤

PIWI家族成员包含保守的PAZ和PIWI区域,在干细胞自我更新、精子发生、RNA干扰和翻译调控中扮演重要角色。最近研究发现,一些PIWI在肿瘤中呈特异性表达,并与肿瘤的发生、发展相关。PIWI将有可能成为肿瘤诊断和预后判断的一个新的重要指标。研究PIWI表达调控机制,可探讨PIWI在肿瘤基因治疗方面的可行性。

微小RNA调控靶基因作用机制的研究进展

微小RNA是一类通过转录后调控机制对基因进行调控的非编码的短链RNA。研究发现微小RNA的功能涉及多种生物学过程,与肿瘤的发生、发展和多种疾病密切相关。本文就微小RNA形成过程及对靶基因调控机制的研究进展作一综述。

Argonaute系列蛋白多克隆抗体制备和鉴定及组织定位

目的制备一系列Argonaute(简称AGO)蛋白多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类组织中的分布。方法合成特异性AGO多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO的免疫组化研究。结果通过构建系列AGO多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,成功制备了3个兔抗人AGO蛋白多克隆抗体,经ELISA及Western blot证实兔抗人AGO抗体可特异性识别AGO多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在部分肿瘤组织上皮来源细胞胞浆中呈阳性染色。结论本项研究成功制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,为进一步研究AGO在miRNA/RNAi通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具。

人Argonaute2蛋白多克隆抗体制备及初步应用

目的:制备人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法:用DNAstar软件寻找抗原性高的Ago2序列区域(命名为k-Ago2),构建k-Ago2的表达质粒,转化大肠杆菌并诱导表达。融合蛋白经切胶回收纯化后免疫大白兔制备抗体。以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测Ago2在细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察Ago2的细胞定位。结果:成功构建表达质粒,继而k-Ago2得以表达与纯化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗体。ELISA检测抗体效价为1∶19 000,Western blot确定抗体具有高度特异性,并成功地用该抗体检测到Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。结论:Ago2多克隆抗体的成功制备,对RNAi机制的深入研究及其进一步的临床应用均具有重要价值。