小鼠Arl8a基因逆转录病毒载体MSCV-GFP-Arl8a的构建

目的:克隆小鼠Arl8a(mArl8a)cDNA,构建带有检测标签的逆转录病毒载体系统,并检测由该病毒系统介导的mArl8a基因在骨髓来源树突状细胞中的表达。方法:从培养的小鼠骨髓来源树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出mArl8a基因片段,再将其克隆入pDrive克隆载体并测序。然后将mArl8a目的基因插入逆转录病毒载体MSCV-GFP中,以磷酸钙法转染294T包装细胞,收集病毒上清感染树突状细胞后,通过流式细胞术检测mArl8a的表达。结果与结论:成功克隆了mArl8a的cDNA,并成功构建其重组逆转录病毒载体MSCV-GFP-Arl8a,该载体可有效将Arl8a基因转移到骨髓来源的树突状细胞中,转染效率达28.3%。

Arl8a与树突状细胞TLR4-TRIF信号途径的相关性

目的 探讨ADP-核糖基化因子样8A（ADP-ribosylation factor-like 8A,Arl8a）与树突状细胞（dendritic cell,DC）中TLR4-TRIF-GEFH1-RhoB信号途径的相关性.方法 从野生型和TRIF敲除基因（TRIFKO）小鼠中分离和培养DC,LPS刺激后收集细胞扩增总cDNA,通过实时定量PCR检测Arl8a的mRNA表达.然后用鸟嘌呤核苷酸交换因子H1（GEFH1）的siRNA转染来自野生型小鼠的DC,进行LPS刺激或未刺激处理并检测Arl8a的mRNA表达.再用GEFH1和Arl8a的siRNA转染DC,LPS刺激后检测RhoB的mRNA表达.结果 在LPS刺激后,Arl8a的mRNA表达在野生型小鼠的DC中增加,在TRIFKO小鼠的DC中则未被上调.此外,在野生型小鼠中Arl8a的mRNA上调可被GEFH1的siRNA明显抑制（P＜0.01）.而Arl8a和GEFH1的siRNA均能显著抑制RhoB的mRNA表达（P＜0.01）.结论 Arl8a的表达与DC的TRL4-TRIF途径有关,并且在转录水平与GEFH1和RhoB相关.

Arl8a与树突状细胞TLR4两条下游途径的相关性

为探讨Arl8a(ADP-ribosylation factor-like 8A)与树突状细胞(dendritic cells,DCs)TLR4两条下游信号途径的关系,用Arl8a和GEFH1(guanine nucleotide-exchange factors H1)的siRNA转染来自野生型小鼠的DC,进行LPS刺激或未刺激处理后,检测TLR4-TRIF途径中RhoB靶蛋白MYH9的mRNA表达。然后从野生型和IFNα/β受体基因敲除小鼠中分离和培养DC,LPS刺激后收集细胞扩增总cDNA,通过实时定量PCR检测Arl8a的mRNA表达。再用Arl8a的siRNA转染DC,LPS刺激后检测IL-6和IL-12a的mRNA表达。结果表明,Arl8a和GEFH1的siRNA均能显著抑制LPS介导的MYH9的mRNA表达(P<0.01),而且在LPS刺激后,Arl8a的mRNA表达在野生型小鼠的DC中增加,在IFNα/β受体基因敲除小鼠的DC中则未被上调。此外,Arl8a的siRNA对IL-6和IL-12a的mRNA表达没有显著效应。以上结果提示,在转录水平,Arl8a和GEFH1均对MYH9的表达有影响,并且Arl8a基因的表达与TRIF-IFNβ途径有关,Arl8a可能与MyD88途径中细胞因子IL-6和IL-12a的表达无关。