猪瘟病毒装甲RNA颗粒质控品的研制及评估

[目的]研制一种安全稳定高效的猪瘟核酸检测质控品,为猪瘟疫病监测提供技术支持。[方法]将猪瘟病毒核酸检测靶基因构入至新型装甲RNA表达载体pTMACC,转化、表达并纯化,制备猪瘟病毒装甲RNA质控品。借助电泳、电镜、动态散射分析鉴定该物质结构特性,并对其均匀性、稳定性进行分析,评估其实用性能。[结果]该装甲RNA颗粒含有猪瘟病毒特异性基因,序列溯源至法国Thiverval株;为RNA-蛋白复合物,颗粒呈直径约26 nm的多边形;该质控品均匀、稳定,-20℃至少稳定保存36个月;经8家权威实验室性能评估,该物质可以作为猪瘟病毒核酸检测质控品。[结论]猪瘟病毒装甲RNA质控品均匀性良好,稳定性强,无生物传染性,核酸RNA不易降解,可稳定保存,进一步保障猪瘟疫病的临床检测的准确性。

基于Armored RNA的BCR-ABL融合基因质控物研制

目的制备以MS2噬菌体装甲RNA(Armored RNA)为材料的BCR-ABL融合基因质控物。方法获取临床p210型BCR-ABL融合基因骨髓标本cDNA,PCR扩增p210型BCR-ABL融合基因片段和ABL内参基因片段。将MS2噬菌体成熟蛋白基因和衣壳蛋白基因克隆于pACYCDuet-1,制成pACYC-MS2,然后将p210型BCR-ABL融合基因和ABL内参基因分别插入pACYC-MS2载体,经原核表达、分子筛纯化、反转录-PCR鉴定后分别制成包装有p210型BCR-ABL融合基因和ABL内参基因片段的病毒样颗粒(VLPs)。进行稳定性、均一性检测,同时判断质控物的适用性。结果成功制备了包装有p210型BCR-ABL融合基因和ABL内参基因的VLPs质控物。均一性检测表明质控物目的片段拷贝数水平是均一的。稳定性检测显示质控物标本在-20℃可至少稳定保存7个月,4℃稳定保存3个月,室温稳定保存15 d,37℃稳定保存1周。用实时荧光定量PCR试剂盒检测质控物水平,pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs标准曲线的R2分别为0.9940和0.9917,具有很好的适用性。结论将Armored RNA作为材料所制备的BCR-ABL融合基因质控物稳定性、均一性较好,适用于评价BCR-ABL融合基因检测试剂盒的性能,具有广泛的应用前景。

含4种食源性病毒检测靶标多联装甲RNA的制备、纯化与定值

基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台构建同时含有诺如病毒(norovirus,NoV)、甲肝病毒(hepatitis Avirus,HAV)、轮状病毒(rotavirus,RV)、星状病毒(astrovirus,AstV)检测靶标RNA的多联装甲RNA(multiplexarmoredRNA,AR-MulV),并进行纯化与初步定值。结果表明,重组质粒在大肠杆菌中成功表达,表达产物大小约为14.1 kDa;制备的AR-MulV经纯化后无杂蛋白与残留重组质粒,电镜下可见大量结构形态完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm。初步定值结果显示,AR-MulV中GⅠ型NoV、GⅡ型NoV、HAV、RV和AstV检测靶标RNA的含量分别为(1.24±0.2)×10~7、(2.54±0.6)×10~7、(2.24±0.3)×10~7、(2.96±0.5)×10~7 copies/μL和(3.19±0.4)×10~7 copies/μL。本研究基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台成功制备同时包含4种食源性病毒标准方法检测靶标的多联装甲RNA,为食源性病毒的分子检测以及多重实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应阳性质控样品的研发提供新思路。

猪流感病毒核酸检测装甲RNA质控样品的研制

为研制一种可以应用于猪流感病毒(SIV)核酸检测的质控品,本研究选取MS2噬菌体装甲RNA(Armored RNA)作为RNA病毒核酸检测质控样品,将MS2噬菌体成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点及SIV M基因克隆于表达载体pET-32a中,经原核表达后,利用Cellufine sulfate层析柱纯化,RT-PCR和实时荧光RT-PCR鉴定表明制备的装甲RNA(AR-SIVM)病毒样颗粒中包装有SIV M基因。稳定性研究显示,AR-SIVM可以耐受RNase的降解,并且在-20℃和4℃至少可以保存3个月。试验结果表明,AR-SIVM作为SIV核酸检测质控样品,能够实现对检测全过程(核酸提取、反转录和PCR)的质量控制。

猪塞内卡病毒(SVA)和O型口蹄疫病毒双重荧光RT-PCR检测方法中阳性参考品的制备

为制备猪塞内卡病毒(SVA)和O型口蹄疫病毒(FMDV-O)阳性质控品,根据选择的目的基因片段,设计阳性参考品序列,通过基因拼接技术和装甲RNA技术,制备含有口蹄疫O型病毒和塞内卡病毒目的基因的装甲RNA病毒样颗粒,用来作为塞内卡病毒(SVA)和O型口蹄疫病毒(FMDV-O)的阳性参考品。结果表明,该阳性质控品无生物传染性,可以真实模拟病毒粒子结构,耐受DNaseI及RNaseA,稳定性高,在-70℃保存18个月,荧光RT-PCR检测结果均无显著差异。本试验制备的含有猪O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒目的基因的装甲RNA病毒样颗粒,可以作为SVA和FMDV-O双重荧光RT-PCR检测方法中进行质量控制的阳性参考品。

GⅠ/GⅡ型诺如病毒两联装甲RNA标准样品的研制

针对目前缺乏适配多项检测标准、稳定、安全的诺如病毒RNA标准样品的问题,研制基于MS2噬菌体内含常见GⅠ/GⅡ型诺如病毒检测靶标两联装甲RNA标准参考样品。人工合成MS2噬菌体成熟酶基因、衣壳蛋白基因、包装位点及GⅠ/GⅡ型诺如病毒靶标基因,克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-MS2-NoV。经大肠杆菌BL21诱导表达,先后利用PEG6000、酶处理和丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化表达产物。SDS-PAGE和透射电镜鉴定产物大小及结构,荧光定量PCR检测有无残留核酸。之后对纯化的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)开展定值、均匀性和短期稳定性研究。SDS-PAGE结果表明重组质粒在BL21中表达出了目的蛋白,大小在10~15ku之间,与预期一致;纯化后的VLPs无杂蛋白和残留核酸;透射电镜下呈结构完整、大小均一的球状,直径约25 nm。纯化后AR-NoV中GⅠ型和GⅡ型靶标定值结果分别为(4.04±0.62)×10^(7) copies/μL和(6.16±0.30)×10^(7) copies/μL。单因素方差检验证实样品均一性良好,F<F0.05(25,52);短期稳定性研究结果表明AR-No V在37℃至少可稳定保存15 d,25℃至少稳定保存24d。本研究制备的诺如病毒GI/GII型两联装甲RNA标准样品稳定均一,拷贝数高,能够为GⅠ/GⅡ型诺如病毒核酸分子检测提供全过程质控。

装甲RNA在牡蛎中诺如病毒4种RNA提取方法比较研究中的应用

RNA提取是诺如病毒检测的关键步骤,而目前贝类中诺如病毒RNA提取、检测方法的比较与评价常囿于缺乏量值明确、无生物安全隐患的标准样品作为参考依据。本研究将前期制备的GⅡ型诺如病毒装甲RNA (3.0×10^10拷贝)作为标准样品,人工污染牡蛎(Ostrea gigas tnunb)消化腺匀浆物,用4种常见RNA提取方法:TRIzol试剂、Viral RNA Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit、柱式病毒RNAOUT试剂盒,分别提取RNA,经实时荧光RT-PCR检测后,利用标准曲线进行定量分析,分别计算4种方法对装甲RNA的回收率。结果显示,对于匀浆样本,TRIzol法对装甲RNA的回收率最高(6.80±0.89)%,显著高于Viral RNA Kit (4.51±2.28)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit (0.24±0.05)%与柱式病毒RNAOUT试剂盒(0.11±0.02)%(P<0.05);对于冻干样本,Viral RNA Kit对装甲RNA的回收率最高(8.71±0.17)%,显著高于TRIzol试剂(7.12±0.64)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit(0.33±0.12)%与柱式病毒RNAOUT试剂盒(0.06±0.01)%(P<0.05)。研究表明,TRIzol试剂与Viral RNA Kit对牡蛎消化腺样本中人工添加的装甲RNA均有良好的回收效果,同时也提示装甲RNA可作为一种良好的标准样品用于不同RNA提取试剂盒方法的评价与比较研究。

RNA病毒质控物研究进展

RNA质控物是病毒分子生物学检测的关键因素,病毒颗粒和裸露的RNA片段由于有生物传染性,易降解而适合用作RNA质控物。近年来发展起来的内含靶RNA序列的盔甲RNA生物安全性高、不易降解、能全程参与病毒核酸的提取和反应,是理想的RNA病毒质控物。

仙台病毒假病毒装甲RNA标准质控品的制备及其应用

目的基于Ms2噬菌体制备内含仙台病毒(Sendai virus,SeV)RNA的假病毒装甲RNA标准质控品,以期应用于SeV感染的诊断及该病毒的分子生物学安全检测。方法将SeV的L基因片段插入质粒pET-28b-Ms2中,构建重组质粒pET-28b-Ms2-L(SeV)。将重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,即SeV假病毒装甲RNA标准质控品。将标准质控品置电镜下观察其形态,并进行10%SDS-PAGE分析、抗DNaseⅠ及抗RNsaeA试验、稳定性分析。采用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术对SeV、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)、小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)、汉坦病毒(Hantaan virus,HV)、呼肠弧病毒Ⅲ型(reovirus typeⅢ,ReoⅢ)、小鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)进行检测,验证标准质控品的效果。结果标准质控品于电镜下呈Ms2噬菌体假病毒颗粒结构,相对分子质量约为14000,可有效抵抗DNaseⅠ及RNsaeA的降解。标准质控品于-80℃保存6个月、-20℃保存6个月、28℃保存5、10、15 d后仍具有良好的稳定性。仅SeV可见RPA特异性扩增曲线,其他病毒均未出现扩增曲线。结论本研究构建的SeV假病毒装甲RNA标准质控品具有良好的稳定性及特异性,可作为SeV的各项分子生物学安全检测的阳性对照。

基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品的制备

【目的】利用MS2噬菌体外壳蛋白可在体外自组装并包封外源核酸的特点,制备RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品,并研究其稳定性和耐Rnase降解特性。【方法】选择猪流行性腹泻病毒保守性强的N蛋白基因为靶序列,插入到携带有MS2噬菌体外壳蛋白和PAC位点基因的下游,构建重组载体,经原核表达系统,表达重组蛋白,目的蛋白经过硫酸铵和凝胶过滤层析纯化,以及Benzonase核酸酶消化,利用电镜对嵌合蛋白进行物理表征,通过Taqman荧光RT-PCR验证盔甲RNA热稳定性及耐Rnase攻击能力。【结果】成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白、PAC位点和猪流行性腹泻病毒靶基因的重组载体。经过原核表达和纯化,得到均一的、直径为23~28 nm的MS2病毒样颗粒,该颗粒经核酸酶消化、RNA提取和荧光RT-PCR,证实其形成了包封靶基因的盔甲RNA。该盔甲RNA可以耐受Rnase的降解,并且无菌条件下可在37℃稳定存在15 d。【结论】MS2噬菌体外壳蛋白体外包封PEDV N蛋白靶序列制备的病毒样颗粒,可以作为RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒的质控品(盔甲RNA),其热稳定性好,耐Rnase攻击,可全程监控整个检测过程。

含有H3N8马流感病毒HA基因噬菌体病毒样颗粒的构建与纯化

为构建含H3N8马流感(EIV)HA基因的噬菌体病毒样颗粒(VLPs),本研究将编码组氨酸标签序列插入MS2噬菌体编码外壳蛋白的β发夹环结构序列中,构建含有重组组氨酸标签的MS2噬菌体外壳蛋白和表达成熟酶蛋白基因的重组质粒p NH-MS2his。并通过RT-RCR技术扩增H3N8亚型EIV的HA基因,将其克隆于p NH-MS2his中,构建原核重组表达质粒p NH-MS2his-H3,并将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明,表达的重组蛋白能够自主装配形成VLPs,其中含有H3N8亚型EIV的HA基因RNA序列,并且该RNA序列具有良好的稳定性,可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品用于临床及海关样品检测。

基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术的诺如病毒RNA标准参考样品的研制

目的：针对目前检测领域缺乏诺如病毒（Norovirus,No V）核酸标准样品这一瓶颈,基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术构建内含GII型No V检测靶标RNA的病毒样颗粒（virus like particles,VLPs）标准参考样品。方法：人工合成包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、ISO/T15216-2 2012中规定的GII型No V检测靶标对应的c DNA序列及辅助多克隆位点的DNA片段QINVGII,将其克隆到p ET-28a（＋）载体中,构建重组质粒p ET-QINVGII。将p ET-QINVGII转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞并诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和透射电镜分析后,利用氯化铯密度梯度离心,制备纯化VLPs,并对纯化后的VLPs开展均匀性、稳定性及定值研究。结果：SDS-PAGE结果证实重组大肠杆菌在14.1k Da左右有目的条带表达;透射电镜下可观察到大量结构完整、直径约为25nm的VLPs。定值结果显示,制备的VLPs样品中GII型No V检测靶标RNA的含量为（1.06±0.06）×107copies/μl;均匀性分析结果表明样品均匀性良好,即F=2.24< F0.05 ( 9 , 20 ) ；稳定性结果表明，制备的 VLPs 在 37 ℃ 可保存 12 天、室温（ 20 ~25 ℃ ）可保存 24 天、 4 ℃ 至少可保存 90 天、-20 ℃ 至少可保存 200 天、-80 ℃ 至少可保存 300 天。结论：基于 Qbeta 噬菌体制备的 NoV 装甲 RNA 均匀性和稳定性良好，拷贝数高，为 NOV 分子检测提供了良好的标准参考样品。

基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品。【方法】人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察。通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究。【结果】SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)×107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23<F0.05 (9,20),证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37°C保存9 d,25°C保存25 d,4°C保存40 d,-20°C保存180 d,-80°C至少保存360 d。【结论】基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。

基于Qβ噬菌体的A群轮状病毒装甲RNA标准参考样品的研制

目的基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含A群轮状病毒(Rotavirus,RV)检测靶标的装甲RNA(Rotavirus armored RNA,AR-RV),并开展系统的初步定值、均匀性、稳定性研究。方法人工合成核酸片段QβSNRV,该片段5'端至3'端依次为Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、RV检测靶标cDNA序列、多克隆位点序列,并将其克隆到pET-28a(+)载体中构建重组质粒pET-QβSNRV。将pET-QβSNRV转化大肠埃希菌BL21(DE3)并诱导表达,利用氯化铯密度梯度超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析纯化AR-RV后电镜观察,并参照GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》规定的方法与原则对制备的AR-RV开展定值、均匀性和稳定性研究。结果十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)结果证实重组质粒在大肠埃希菌中有目的条带表达,大小约为14.1 kDa;经氯化铯密度梯度超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析纯化的AR-RV无杂蛋白干扰;电镜下可见结构完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm;定值结果显示,AR-RV中检测靶标RNA的含量为(1.02±0.3)×107copies/μl;均匀性分析结果为F=0.66<F0.05(9,20),表明样品均匀性良好;稳定性结果表明,AR-RV在37℃可保存15 d、25℃可保存15 d、4℃可保存50 d、-20℃至少可保存270 d、-80℃至少可保存360 d。结论本研究基于Qβ噬菌体制备的AR-RV拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为RV分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。

双表达系统制备新型冠状病毒N基因装甲RNA颗粒的研究

人工合成新型冠状病毒(SARS-CoV-2)标准参考毒株Wuhan/WIV04/2019完整N基因序列(1260 bp)和包含MS2噬菌体基因组成熟酶蛋白、衣壳蛋白基因序列(1682 bp),分别克隆到原核双表达质粒pACYCDuet-1的2个不同的多克隆位点,从而获得重组表达质粒pACYC-MS2-CoV2N。将pACYC-MS2-CoV2N转化表达菌株BL21(DE3),经表达、纯化,获得含有SARS-CoV-2完整N基因的装甲RNA颗粒。经鉴定装甲RNA颗粒含有SARS-CoV-2完整N基因且没有DNA残留,并可抵抗RNase消化。采用荧光RT-PCR对装甲RNA颗粒进行定值后,制备出了用于SARS-CoV-2 N基因检测的核酸质控品,该核酸质控品均匀、稳定、可重复性好,在2~8℃可保存180 d,可用于SARS-CoV-2核酸检测的质控。

西尼罗病毒装甲RNA质控品的制备

目的 制备一种西尼罗病毒装甲RNA质控品,用于西尼罗病毒核酸检测的全过程质控。方法 依据行业标准的引物WN233/WN640c、WN1160/WN1209序列,扩增西尼罗病毒衣壳蛋白C部分基因片段,将其克隆至含有MS2噬菌体衣壳蛋白基因的表达质粒pET32a-CP中,经原核表达后获得的病毒样颗粒即为装甲RNA。用DNaseI和RNase A消化装甲RNA,提取RNA,进行RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测。将装甲RNA在4℃、-20℃和37℃保存15 d,定时提取RNA进行检测。结果 参照行业标准,用RT-PCR和荧光定量PCR均能扩增酶消化后的病毒样颗粒RNA,表明制备的装甲RNA含有插入的目的基因片段C,且耐受核糖核酸酶的降解。装甲RNA在4℃、-20℃和37℃环境中保存5~15 d,用RT-PCR和荧光定量PCR仍能扩增到特异性目的 条带,有扩增曲线,表明制备的病毒样颗粒在4℃、-20℃和37℃可以至少保存15 d。结论 制备的西尼罗病毒装甲RNA病毒样颗粒可以作为西尼罗病毒核酸检测的质控品,实现对检测全过程的质量控制。

基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)质控品制备

目的:制备热稳定性好、耐RNase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品。方法:分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A。合成包含ORF1ab基因、N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S。通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性。结果:成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol/L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一、直径为23~28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA。加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天。结论:在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品。

含马动脉炎病毒N基因的病毒样颗粒的制备

为了构建易于纯化且耐RNase酶的含有马动脉炎病毒N基因的病毒样颗粒,通过RT-RCR扩增马病毒性动脉炎病毒的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS2his载体中,构建重组原核表达载体pNH-MS2his-N。将重组质粒pNH-MS2his-N转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化。对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性实验。结果表明该病毒样颗粒含马病毒性动脉炎病毒N基因,并且稳定性良好,构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。

装载戊型肝炎病毒核酸片段的重组MS2噬菌体衣壳的制备及其特性研究

为制备一种可以实际应用于戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)核酸检测的质控品,即装载戊型肝炎病毒核酸片段的重组MS2噬菌体衣壳(rHEPC)。根据装甲RNA技术原理,设计将MS2噬菌体基因组的5’端部分非编码区、成熟酶蛋白、衣壳蛋白以及部分复制酶起始位点等编码基因与HEV ORF2保守区部分基因序列串联并合成目标基因MS2-HEV。随后将MS2-HEV基因克隆、插入原核表达载体pET-28b中构建pET-28b-MS2/HEV重组质粒,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),经过1mM/L IPTG诱导培养4h后,SDS-PAGE鉴定表达情况;将验证的表达菌体超声破碎、离心、取上清、去除核酸杂质后再经超滤离心纯化、浓缩,电镜分析回收浓缩的rHEPC形态;梯度稀释rHEPC进行稳定性鉴定包括DNase I、RNase A抗性以及保存期三方面的稳定性试验检测。SDS-PAGE分析结果表明重组MS2-HEV基因获得有效表达,重组rHEPC纯度高无杂带;RT-PCR鉴定结果表明设计的HEV保守基因序列成功地被包装到重组rHEPC中。进一步的病毒颗粒稳定性试验结果表明制备的rHEPC能够有效抵抗高浓度的DNase I和RNase A的降解作用,并且在-20℃条件下可以持续保存7个月而无明显降解。上述结果表明制备的rHEPC达到了作为RNA病毒核酸检测阳性质控品的基本要求。