骨髓间质干细胞复合生物陶瓷构建组织工程化人工软骨

目的 探索以多孔β-磷酸三钙 (β- TCP)生物陶瓷材料为支架 ,经体外诱导的骨髓间质干细胞 (MSCs)为种子细胞 ,构建组织工程化软骨修复羊关节软骨缺损的可行性。方法 将 2 8只中国美利奴绵羊分为三组。实验组 (n=12 ) :分离培养羊自体第 7代 MSCs,经转化生长因子 - β诱导后接种到预制的 β- TCP多孔生物陶瓷材料上 ,细胞 -材料复合体经体外孵育后 ,无菌条件下植入预制的羊单侧肱骨近端关节面缺损处 ;单纯材料组 (n=12 ) :采用单纯β- TCP材料修复羊关节软骨缺损 ;空白对照组 (n=4 ) :制备的羊关节软骨缺损区未做任何修复。术后 12周和 2 4周分别取材 ,进行组织学、组织化学和免疫组织化学分析。结果 实验组术后 12周羊关节软骨缺损处肉眼可见透明软骨样组织形成 ,组织学检查发现 ,材料降解明显 ,未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生软骨组织 ,软骨细胞外基质丰富 , 型胶原染色阳性 ;术后 2 4周 ,支架材料几乎完全降解 ,缺损区被新生软骨组织所取代。单纯材料组术后 12周 ,缺损区边缘有新生软骨组织向支架材料内长入 ,支架材料吸收明显 ;术后 2 4周 ,见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生软骨组织逐渐增多 ,但材料的中心部位未发现新生软骨形成。空白对照组至术后 2 4周 。

组织工程软骨与柚皮苷联合修复兔膝关节软骨缺损的组织学证实

背景:目前临床上虽有多种方法用于治疗软骨缺损,但没有从根本上解决关节软骨缺损修复问题。目的:通过组织学研究进一步评价柚皮苷结合组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的效果。方法:取兔骨髓间充质干细胞体外增殖后,复合于改建后的脱细胞真皮基质载体上,制成组织工程软骨,植入到兔膝关节软骨缺损,并以柚皮苷汤灌胃,于4,8周后分别对修复组织进行苏木精-伊红、Masson三色染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原染色、Ⅹ型胶原染色等组织学检查。结果与结论:术后8周,柚皮苷结合干细胞复合体组缺损处修复组织变成乳白色,半透明光滑组织,缺损修复组织与周围正常软骨已基本难区分,表面光滑。组织学检查发现修复缺损处基本为新生软骨填充。结果证实,柚皮苷结合组织工程软骨能提高家兔膝关节软骨缺损的修复质量。

压应变作用下组织工程软骨的构建

在压应变作用下构建组织工程化软骨。以大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,以壳聚糖海绵为支架材料,利用压应变加载装置对细胞-壳聚糖海绵支架材料的复合物进行体外动态加载,7d后植入大鼠背部皮下,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白的分泌,甲苯胺蓝染色检测酸性糖胺多糖的分泌;利用材料试验机对组织块进行生物力学性能检测,从弹性模量方面对比工程化软骨与正常软骨的差异。在大小为1%、频率为1Hz的压应变条件下,构建的组织工程化软骨经体内移植后,分泌软骨基质Ⅱ型胶原及酸性糖胺多糖,其弹性模量较植入前显著增强。在压应变作用下,细胞复合壳聚糖支架材料可以形成初级的组织工程化软骨。

BMSCs/PLGA复合物修复山羊下颌髁突骨软骨缺损的实验研究

目的:观察利用BMSCs/PLGA复合物修复山羊下颌髁突骨软骨缺损的可行性及效果。方法:选取36只成年健康山羊,一侧关节制备3 mm直径、5 mm深的髁突表面骨软骨缺损,根据植入物不同分为BMSCs/PLGA复合物组、PLGA组及空白组,另一侧关节作为正常对照组。分别在术后6周和24周后处死每组6只动物,标本进行大体及组织学检查比较。结果:术后24周时空白组下颌髁突骨软骨缺损未能自发修复;植入PLGA组的缺损表面虽有软骨形成,但连续性有中断;植入BMSCs/PLGA组的修复效果最佳,表面软骨接近正常纤维软骨。组织学评分结果也显示BMSCs/PLGA组明显优于材料组和空白组。结论:BMSCs/PLGA复合物可以作为一种修复下颌髁突骨软骨缺损的新的有效方法。

人脱细胞羊膜与骨髓间充质干细胞复合体修复关节软骨缺损

背景:骨髓间充质干细胞在软骨组织工程研究中作为一种常见的种子细胞被广泛应用于软骨缺损修复。目的:以人脱细胞羊膜作为细胞支架负载兔骨髓间充质干细胞用以修复兔股骨髁间窝软骨缺损。方法:将兔骨髓间充质干细胞接种于人脱细胞羊膜上,体外共培养2周。建立兔股骨髁间窝区关节软骨缺损模型,右膝软骨缺损处设为空白对照组,不植入任何材料,左膝软骨缺损处为实验侧,分别植入人脱细胞羊膜-骨髓间充质干细胞和单纯人脱细胞羊膜。术后第8,12周,取膝关节软骨缺损部位新生组织,行大体观察、组织学检测,评估新生软骨质量。结果与结论:(1)大体观察结果:人脱细胞羊膜-骨髓间充质干细胞组有类软骨形成,质地较软,与周围正常软骨结合良好;人脱细胞羊膜组未形成软骨组织。空白对照组缺损区只由纤维样组织填充;(2)组织学观察结果:人脱细胞羊膜-骨髓间充质干细胞组新生出软骨细胞及软骨陷窝,并形成软骨基质,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。软骨基质甲苯胺蓝染色较深。人脱细胞羊膜组仅有极少量的软骨细胞,甲苯胺蓝染色较浅,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,无软骨基质形成。空白对照组为纤维组织修复,甲苯胺蓝染色较浅;(3)结果表明,人脱细胞羊膜有利于骨髓间充质干细胞的软骨化,软骨缺损处由类软骨组织填充,能够有效修复关节软骨缺损。

膝关节腔内培养骨髓间充质干细胞复合脱钙骨的组织工程软骨

背景:如何更好地以组织工程学方法修复关节软骨缺损并达到良好的远期疗效目前尚无公识。目的:创新性地在膝关节腔内培养兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的组织工程软骨。方法:采用全骨髓贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,DMEM/F12完全培养基培养,成软骨诱导条件培养基诱导分化。取同种异体兔的髂骨和椎体骨制作成脱钙骨支架,诱导后的骨髓间充质干细胞种植于脱钙骨支架上,培养1d后将细胞-支架复合物用筋膜包裹置于兔左膝关节腔内培养,单纯脱钙骨支架筋膜包裹置入右膝关节腔。于培养第4,8,12周分别取材,行大体观察并制成石蜡切片,采用苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组化染色方法进行组织学观察。结果与结论:培养4,8周,细胞-支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化的平均吸光度值(A)分别为0.263±0.031,0.340±0.052,单纯支架组标本分别为0.147±0.027,0.165±0.030,两组比较差异有显著性意义(P<0.05);培养12周细胞-支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化A值平均为0.362±0.037,标本类似正常软骨外观,Ⅱ型胶原免疫组化反应呈阳性;而单纯支架组脱钙骨支架降解。培养12周细胞-支架组苏木精-伊红染色结果显示细胞数量多,脱钙骨支架基本被吸收;而甲苯胺蓝染色结果显示有被染成紫红色的异染性基质形成。结果提示兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨可在兔膝关节腔内培养出组织工程软骨。

骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的:体外培养骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)并以壳聚糖作为组织工程细胞外支架构建组织工程软骨,探讨其在软骨组织工程中的应用。方法:分离兔BM-MSCs并进行体外传代培养。观察细胞形态及其变化,检测免疫表型CD71的表达;绘制并比较不同代次细胞的生长曲线。传代培养后,检测第2、3、4代BM-MSCs的软骨特异性Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)的mRNA的表达。取6只新西兰成年白兔,随机分为两组,A组为单纯壳聚糖支架修复组,B组为壳聚糖支架复合BM-MSCs修复组。分别于术后4、8周处死动物,观察新生区软骨组织修复情况。结果:体外培养获得高纯度且传代能力强的BM-MSCs。修复术后4周,A组仅有纤维组织增生,甲苯胺蓝染色较淡;B组关节软组织缺损处有软骨样组织及胶原生成。术后8周,B组关节软骨缺损处有较明显的软骨组织增生;A组仅在与正常软骨交界处有少量的软骨组织生成;免疫组织化学显示B组ColⅡ有表达。结论:密度梯度离心法联合差速贴壁法能提高BM-MSCs的纯度,通过该途径获得的BM-MSCs可作为软骨组织工程的种子细胞。壳聚糖是比较理想的新型软骨组织工程支架,以BMMSCs复合壳聚糖构建的组织工程软骨能够较好地修复兔关节软骨缺损。

骨髓间充质干细胞与壳聚糖复合修复关节软骨损伤

背景:创伤等导致的关节软骨缺损是国内外骨科界面临的难题,组织工程学技术为软骨缺损的修复提供了新方法。目的:探讨壳聚糖-骨髓间充质干细胞复合材料修复兔膝关节软骨缺损的可行性。方法:将培养的兔骨髓间充质干细胞种植到壳聚糖支架上体外构建壳聚糖-骨髓间充质干细胞复合材料,移植到兔关节软骨缺损处为实验组,不予以特殊处理为对照组。术后6,12周,大体观察以及甲苯胺蓝染色评定两组软骨组织修复情况。结果与结论:术后6周,对照组仅有纤维组织增生,实验组关节软骨缺损处有软骨样组织生成。术后12周,对照组软骨缺损边缘可观察到少量类透明软骨组织,实验组缺损区完全覆盖有光滑、透明软骨组织。术后12周,对照组甲苯胺蓝染色较淡,有少量软骨组织生成,实验组甲苯胺蓝染色较明显,缺损完全被透明软骨组织所覆盖,软骨细胞较多。结果表明兔骨髓间充质干细胞-壳聚糖支架复合材料能更好的引导软骨组织的生成,促进软骨缺损修复。

诱导干细胞技术制备软骨细胞治疗关节软骨损伤的动物实验研究

目的探讨利用诱导干细胞技术制备软骨细胞治疗关节软骨损伤的价值。方法选择健康新西兰大白兔12只,其中3只用于分离培养骨髓间充质干细胞(BMMSC),将其余白兔均分为诱导组、空白对照组及支架组(每组3只)。建立软骨缺损动物模型后,空白对照组关节软骨缺损区不作任何处理,支架组只将25%可注射型支架材料Pluronic F-127注入软骨缺损区,诱导组将25%可注射型支架材料Pluronic F-127注射到最佳诱导分化的BMMSC中,再将细胞注入软骨缺损区。干预后15 d,对各组动物关节软骨缺损部位进行大体观察与显微镜下观察,并进行组织学评分。结果定向诱导14 d后,BMMSC由梭形变为多边形,形成软骨样结节。建模后3组实验动物膝关节活动正常,诱导组术后8周关节缺损处完全填充,修复组织表面平整,软骨下区形成新骨;其他两组缺损持续存在,粉红色组织填充底部。诱导组术后4周、8周的组织学评分分别为(6.44±1.11)分和(6.27±1.09)分,均明显低于支架组的(10.41±1.34)分和(9.87±1.23)分(P<0.05),也明显低于空白对照组的(11.09±1.34)分和(9.89±1.33)分(P<0.05)。结论诱导干细胞技术制备的软骨细胞在体外增生分化效果好,而应用于治疗关节软骨损伤可以最大限度地减少创伤。

自体骨髓间充质干细胞和同种异体肋软骨细胞共培养修复五指山小型猪膝关节软骨缺损的实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和肋软骨细胞(costal chondrocytes,CCs)共培养构建组织工程软骨及共培养细胞修复五指山小型猪膝关节软骨缺损的可行性,为临床修复关节软骨缺损提供理论依据和奠定实验基础。方法:密度梯度离心法分离五指山小型猪BMSCs,双酶消化法分离CCs。取第3代BMSCs和第2代CCs,随机分为3组:BMSCs:CCs为1:2的共培养组为A组,单纯CCs为B组,单纯BMSCs为C组。绘制细胞生长曲线图,测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)的能力。将12只五指山小型猪随机分为共培养细胞/胶原膜实验组、胶原膜对照组和空白组。共培养细胞/胶原膜实验组髁间窝软骨缺损处植入共培养细胞/胶原膜,胶原膜对照组单纯植入胶原膜,空白组不做任何植入,于术后第8和16周分别处死6只动物,每组2只。取材行大体观察、软骨组织学评分及病理组织学检测。结果:密度梯度离心法分离的BMSCs生长良好,双酶消化法分离的CCs生物活性良好,共培养细胞生长良好。术后16周共培养细胞/胶原膜实验组修复组织呈透明软骨样,表面光滑平坦,周围软骨及软骨下骨整合良好,而胶原膜对照组和空白组为纤维性修复和无修复。共培养细胞/胶原膜实验组修复组织大体评分明显优于胶原膜对照组和空白组(均P<0.05),胶原膜对照组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:BMSCs,CCs和共培养细胞均适合作为软骨组织工程的种子细胞,其中共培养细胞(BMSCs:CCs为1:2)更具优势;共培养细胞复合胶原膜修复软骨缺损近期效果满意。

大鼠关节软骨来源祖细胞的分离鉴定及成软骨分化

背景:关节软骨来源祖细胞具有较强的软骨分化能力,同时其成骨分化能力有限,但是经过扩增后其细胞特性是否会发生改变及如何改变目前仍没有相关报道。目的:观察不同代次关节软骨来源祖细胞增殖、成骨和成软骨能力的改变情况,并与骨髓间充质干细胞相比较。方法:利用纤连蛋白分选从关节软骨细胞中获得关节软骨来源祖细胞。通过克隆形成实验和CCK-8实验观察关节软骨来源祖细胞增殖能力改变;通过茜素红染色和成骨相关基因表达观察关节软骨来源祖细胞和骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的变化;通过Ⅱ型胶原免疫组化染色和成软骨相关基因表达观察关节软骨来源祖细胞和骨髓间充质干细胞成软骨分化潜能的变化。结果与结论:①通过纤连蛋白分选可从关节软骨细胞中获得具有干细胞特性的关节软骨来源祖细胞,其具有较强增殖能力以及成骨、成软骨分化潜能;②CCK-8和克隆形成实验结果显示随着细胞代次的增加,关节软骨来源祖细胞增殖能力略有下降;③骨髓间充质干细胞具有较强的成骨分化潜能,并且随着细胞扩增未有明显改变,成软骨分化潜能随着细胞扩增逐渐降低;④关节软骨来源祖细胞具有较强的成软骨潜能,并且随着细胞扩增未有明显改变,成骨分化潜能随着细胞扩增逐渐降低;⑤结果表明,关节软骨来源祖细胞的成骨潜能明显低于骨髓间充质干细胞并且随着细胞扩增逐渐减低,成软骨潜能高于骨髓间充质干细胞并且随着细胞扩增成软骨能力未有明显改变,说明关节软骨来源祖细胞可能是一种更加理想的软骨组织工程种子细胞。

猪骨髓间充质干细胞体外构建软骨修复关节软骨缺损的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)体外构建软骨,移植修复大动物大面积关节软骨缺损的可行性。方法以7只长枫杂交猪为动物模型,建立软骨缺损模型,用自体BMSCs体外软骨定向诱导8周的组织工程软骨移植修复,以单纯材料组、空白对照组和正常对照组作为对照。术后6个月取材,行大体及组织学检测,同时于术前、术后抽取关节液,检测IGF-1、IL-1β、MMP-13及TNF-α的表达水平,综合评价修复效果。结果术后6个月取材,实验组获得了较理想的修复效果,修复区软骨组织大体观、组织学表现成熟,类似于正常软骨组织。关节液检测中,实验组IGF-1表达水平显著高于空白对照组及单纯材料组(P<0.05),而IL-1β、MMP-13及TNF-α的表达水平则明显低于空白对照组及单纯材料组(P<0.05)。结论BMSC体外构建组织工程软骨可有效修复猪关节软骨缺损,从而避免或延缓骨关节炎的发生、发展。

骨髓间充质干细胞与软骨细胞体外构建软骨的比较研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)与软骨细胞的体外软骨形成规律及二者软骨形成质量的差异,为BMSCs临床应用转化提供参考依据。方法分别将猪的BMSCs及软骨细胞复合可降解支架进行体外软骨构建,体外构建2、4及8周后,取材行大体及组织学检测。以Ⅱ型胶原免疫组化及番红O染色法分别检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达情况,用ELISA及阿利新兰法测定Ⅱ型胶原及蛋白多糖含量,评估各组的软骨形成规律和形成质量。结果体外4周时BMSCs形成了软骨样细胞,并表达软骨相关的Ⅱ型胶原和蛋白多糖,但其Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量显著低于软骨细胞组;8周时BMSCs形成了成熟的软骨组织,并具有典型的软骨陷窝结构,其在组织结构及生化组成上与软骨细胞组十分接近。结论 BMSCs的体外软骨形成速度较软骨细胞慢,但延长体外诱导时间可显著减小二者在组织结构及生化组成上的差异。

自体骨髓间充质干细胞移植修复兔关节软骨损伤

目的 用组织工程方法修复软骨损伤。 方法 兔骨髓间充质干细胞 (bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells, BMSCs)体外培养扩增诱导分化,用藻酸盐载体材料负载,移植于兔关节软骨损伤区,术后 6周和 12周进行大体、光镜、电镜等观察。 结果 实验组移植 6周后,软骨损伤区由透明软骨样组织填充, 12周后软骨和软骨下骨修复良好,免疫组化和原位杂交证实修复组织内产生了Ⅱ型胶原,透射电镜显示细胞周围有胶原纤维产生。两对照组损伤区由纤维组织修复。 结论 以藻酸盐载体材料负载BMSCs移植可修复关节软骨损伤。

骨髓间充质干细胞复合Ⅱ型胶原修复关节软骨缺损的组织学观察

目的观察向软骨方向诱导分化的自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合Ⅱ型胶原修复兔关节软骨缺损的质量。方法扫描电镜观察Ⅱ型胶原结构。24只新西兰大白兔体外分离BMSCs，进行原代、传代培养，倒置显微镜观察。取第3代BMSCs，软骨诱导培养液培养14d，调整细胞浓度为5×10^6／ml，与Ⅱ型胶原复合培养1周备用，并观察细胞在支架材料中的生长情况。于膝关节股骨滑车处制作一个直径为4mm的圆柱形软骨缺损区，右侧植入复合培养1周的自体BMSCs和Ⅱ型胶原组织（实验组）；左侧单纯植入Ⅱ型胶原（胶原对照组）；另取12只，左右侧均不植入任何材料（空白对照组）。术后2，4，8，12周取材，大体和组织学观察检测修复软骨的质量。结果Ⅱ型胶原呈网架状结构，孔隙大小在40～300μm之间，BMSCs在其中生长良好，软骨基质大量形成。实验组修复的关节面光亮、平整，镜下表现为透明样软骨，软骨细胞排列规律，与宿主软骨整合好；胶原对照组以纤维组织修复为主，与宿主软骨整合差；空白对照组未能修复软骨缺损。组织学评分实验组明显优于两对照组（P〈0．05）。结论自体BMSCs复合Ⅱ型胶原修复软骨缺损质量好，长期疗效需要进一步的观察。

软骨组织工程中种子细胞接种密度和比例的研究进展

目的 综述软骨组织工程中种子细胞接种密度和比例的研究进展。方法 广泛查阅三维结构中构建组织工程软骨的相关文献,对最常用的种子细胞接种密度与比例进行综述。结果 关节软骨细胞(articular chondrocytes,ACHs)和BMSCs是软骨组织工程中最常用的种子细胞,体内、外实验显示两种细胞均具有一定形成透明软骨的能力。而种子细胞的接种密度和比例对最终形成的组织工程软骨质量有重要影响。ACHs或BMSCs细胞接种密度接近或高于正常关节软骨中的细胞密度时,可构建出质量较好的组织工程软骨。在相同培养条件下,BMSCs在单独应用时形成透明软骨的能力不如ACHs或两者共培养。结论 受支架材料、生长因子、细胞代次等因素影响,软骨组织工程中最优的细胞接种密度与比例仍需进一步研究。