人工miRNA沉默基因的研究

人工miRNA(amiRNA)是一种高效的基因沉默技术,其原理是以植物内源miRNA的前体为基本骨架,将其茎环结构中的miRNA/miRNA*序列替换为amiRNA/amiRNA*序列,使产生的amiRNA作用于目标靶基因,以实现对靶基因表达的抑制。以拟南芥中转录因子基因MYB28为例,介绍了amiRNA的设计基本原理和构建方法。在MYB28基因序列的3'端、5'端和中间部分分别设计了amiRNA,以拟南芥内源的miRNA 319a前体为骨架,以靶向于MYB28的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列,在拟南芥中过量表达,获得的转基因植株中MYB28表达水平平均降低了86%。根据试验结果对人工miRNA沉默基因技术的特点及应用前景进行了讨论。

拟南芥miRNA及其靶序列配对特征分析

microRNAs（miRNAs）是真核生物中一类长度约为22 nt的非编码小分子RNA,miRNA与AGO等蛋白形成RISC沉默复合体,通过剪切或翻译抑制对靶基因起负调控作用。对拟南芥miRNA序列及其配对的靶序列间的特征进行了统计分析,结果表明miRNA序列5′端富含A、U,第1、第19碱基位对U、C具有较强的倾向性;miRNA与靶序列间常有1～4个碱基错配,错配碱基常出现在第1,第2和第21位,而第3～第6,第9～第10,第16～第17碱基配对较为保守,为人工合成miRNA的设计及miRNA靶基因的预测以提供了依据。

拟南芥AtLCR67干扰质粒的构建及转基因植株的鉴定

种子发育过程是植物整个生长周期最重要的阶段,涉及到一系列功能物质的合成和转化,是由各种相互关联的基因共同控制完成的,因此,研究该阶段特异性表达的基因对研究种子发育过程非常重要。以种子特异性表达的基因At LCR67为研究对象,通过构建RNAi干扰质粒,借助根癌农杆菌介导的浸花法,将At LCR67基因的RNAi表达框转到拟南芥基因组中;经过PPT抗性筛选与PCR鉴定,成功获得了8株转基因植株。对其中的3株进一步作RT-PCR检测,显示有2株中的At LCR67基因表达被完全抑制,另一株的基因表达水平被抑制了大约70%,结果完全实现了设计目标;同时还发现T2代植株有晚花表型。这两株转基因植株为进一步研究At LCR67功能与作用机制提供了良好的遗传材料。