利用CRISPR/Cas9技术建立斑马鱼Asb11基因敲除品系

Asb11基因被报道与斑马鱼Notch信号的激活有关,本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。因此推测Asb11基因可能是心脏发育相关候选基因。为了阐明Asb11基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用,本文利用CRISPR/Cas9打靶技术构建敲除Asb11基因的斑马鱼品系。首先在线分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点,然后PCR扩增出Asb11基因gRNA的双链c DNA,再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。进行打靶的有效性检测,发现Asb11基因的一号外显子出现了碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对Asb11基因的敲除是有效的。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得了Asb11基因敲除的斑马鱼品系,为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。

利用DNA免疫技术制备ASB11蛋白的多克隆抗体

ASB11参与胚胎神经祖细胞的发育、再生性肌发生以及泛素化等过程,但其机制仍不清楚。为了进一步研究斑马鱼Asb11基因的作用机制,本研究采用DNA免疫技术制备了ASB11多克隆抗体;利用斑马鱼Asb11的c DNA构建p CAGGS-P7/ASB11重组表达质粒,肌肉注射入6-8周龄的BALB/c小鼠体内,诱导抗原蛋白的表达和免疫应答的发生。结果显示,制备的p CAGGS-P7/ASB11重组质粒具有较好的免疫原性;将提取的抗血清进行Western-blot和免疫荧光检测,显示所制备的多克隆抗体抗体效价为1∶400,抗血清抗体能特异的结合ASB11蛋白。本研究为后续的功能研究奠定了基础。