嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因的检测与序列分析

对分离于草鱼、青鱼、鲤鱼、牙鲆、宽体金线蛭、中国林蛙的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hy-drophila),进行Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,TTSS)AscV基因的检测与分析,探讨不同来源嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因的携带与分布情况。利用文献发表的TTSS的AscV基因特异性引物,采用PCR方法扩增该基因片段,选取代表菌株的AscV基因序列,以DNA Star软件与GenBank公布的参考菌株相应基因序列进行同源性比较,构建系统进化树。结果在供试的42株菌中,有34株携带(阳性率80.95%);其中分离于宽体金线蛭的10株有8株携带(阳性率80%)、中国林蛙的11株有10株携带(阳性率90.9%)、牙鲆的10株有9株携带(阳性率90%)、草鱼的7株有3株携带(阳性率42.9%)、青鱼和鲤鱼的各2株均携带(阳性率100%)。所检测的5个代表菌株AscV基因与参考菌株的同源性在81.0%～98.7%之间;供试不同来源菌株之间的同源性在91.2%～99.3%之间。

嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统ascV全长基因的克隆及其在不同菌株中的分布

根据已发表的嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统(TTSS)的ascV基因保守区核苷酸序列设计合成1对引物,以国内疫苗菌株J-1的基因组为模板,通过PCR扩增得到331bp保守基因片段,将目的片段进行测序。在此基础上,分4段克隆J-1株的ascV基因并进一步拼接,全长为2 166bp,同时PCR检测ascV基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。测序分析发现,扩增出的J-1株ascV全长基因与嗜水气单胞菌AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97%、86%、86%,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为86%,与温和气单胞菌的同源性为87%。PCR检测表明,64株能扩增出ascV基因的目的片段,包括2株无毒菌株,而在2株有毒菌株中却未能检测到,说明TTSS在嗜水气单胞菌致病机制上的作用值得进一步探讨。