谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergillus chevalieri var.intermedius)esdC基因全长cDNA克隆与序列分析

为探究esdC基因在谢瓦氏曲霉问型变种的结构特征，从己构建的抑制性差减文库（ssH）中筛选得到。sdC基因的EST序列，采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术扩增该基因片段的5’和3’端，拼接得到全长cDNA1472bp。通过序列分析，该cDNA序列含有一个开放阅读框（ORF），长度为819bp，从396～1214bp，含有30个腺嘌呤尾巴。预测编码273个氨基酸，该蛋白质的等电点pI为9．51，分子量为30．26558kD，为不稳定蛋白。序列同源性分析表明：该基因与费希新萨托菌（Neosartorya fischeri NRRL181）有性发育蛋白EsdC相似度最高，为78％，其保守区序列主要集中于蛋白质的N端。本实验为进一步研究esdC基因的分子功能及可能参与的调控途径奠定基础。

谢瓦氏曲霉间型变种nsdD基因全长克隆及序列分析

为研究谢瓦氏曲霉间型变种中nsdD基因的结构及其与有性产孢的关系,根据同源克隆及染色体步移技术克隆nsdD的全基因序列,并进行生物信息学分析。结果表明:该序列基因全长为1 773bp,开放阅读框长度为1 293bp,编码430个氨基酸,分子质量为46.659 4KD,理论等电点为9.08。序列同源性分析该基因与土曲霉(Aspergillus terreus)nsdD基因相似度最高为69%,含有1个GATA型锌指保守结构域,与其他曲霉的nsdD蛋白保守域相符。

茯砖茶“金花”菌—谢瓦氏曲霉间型变种的孢子产生条件

研究探讨了不同浓度的蔗糖和氯化物、不同温度及不同培养基对茯砖茶“金花”菌——谢瓦氏曲霉间型变种有性孢子和无性孢子产生的影响.结果表明:渗透压在该菌有性孢子和无性孢子产生过程中起主导作用.在低渗透压下,该菌只产生子囊孢子,不产分生孢子;渗透压增大到一定程度时,该菌既产生子囊孢子,又产生分生孢子;随渗透压再继续增大,子囊孢子产量相对减少,最终不产生子囊孢子,而分生孢子产量则愈来愈大,最终只产分生孢子.30～37℃下培养,利于分生孢子产生,在30℃以下,利于子囊孢子产生.在营养丰富的培养基上易产生分生孢子,在营养贫瘠的培养基上不易产生分生孢子.

谢瓦氏曲霉间型变种YchF基因cDNA全长克隆及序列分析

从谢瓦氏曲霉间型变种抑制性差减杂交(SSH)文库中,筛选到一个子囊孢子时期差异表达的序列标签A0128.860,以其序列为模板设计特异性引物,利用RT-PCR及RACE技术克隆获得了该基因的全长cD-NA,命名为eYchF。生物信息学分析显示,该基因包含一个1182bp的完整开放阅读框(ORF),编码393个氨基酸,相对分子质量为43.4669kD,预测的理论等电点为6.99,包括一个保守的G domain(guanine nucleotide-binding domain)和一个TGS(ThrRS,GTPase,Spo T)domain,为疏水蛋白。序列同源性分析表明:该基因与棒曲霉(Aspergillus clavatus NRRL1)的GTP结合蛋白YchF相似度为84%,谢瓦氏曲霉间型变种YchF基因的克隆及生物信息学分析为YchF的进一步研究奠定了基础。

根癌农杆菌介导谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化

利用根癌农杆菌对谢瓦氏曲霉间型变种进行了遗传转化。结果表明:遗传转化的效率为60～90个转化子/106个分生孢子,转化子的遗传性状比较稳定;谢瓦氏曲霉间型变种对潮霉素B比较敏感,20μg/mL就可以抑制真菌的生长。遗传转化体系的建立为后继基因功能的研究提供了重要工具。

茯砖茶“金花”菌生长条件研究

茯砖茶“金花”菌谢瓦氏曲霉间型变种生长的pH值范围在pH3—pH6,最适生长为pH5:最高生长温度为38℃,最适生长温度为30℃,子囊孢子和分生孢子两种单孢子萌发率接近,前者为17％,后者为18.5％,两种单孢菌落特征一致,长势一致,均能产子囊孢子和分生孢子。孢子的有性型和无性型在特定条件下可以互相转化。该菌为同宗结合。

G418抗性基因nptⅡ双元载体的构建及谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化

为给谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergillus chevalieri var.intermedius)多基因功能的研究提供新的选择标记,利用MYA培养基测G418敏感性后,以质粒pcDNA3.1(+)为中间载体构建nptⅡ基因表达元件,利用根癌农杆菌介导法转化至谢瓦氏曲霉间型变种。结果表明:用构巢曲霉PgpdA启动子、nptⅡ基因和构巢曲霉色氨酸C终止子TtrpC组成的G418抗性基因盒替换双元载体pDHt/sk-bar上的草丁膦抗性盒,成功构建双元载体pDHt/sknt,并且通过根癌农杆菌介导的转化获得的G418抗性转化子遗传稳定,nptⅡ基因主要以单拷贝形式插入谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA中。因此,双元载体pDHt/sknt适用于谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化。

茯砖茶“金花”菌分离及鉴定

对不同来源茯砖茶上的“金花”菌的生长发育过程、形态特征、菌落特征、子囊孢子和分生孢子的亚显微结构等进行了研究,鉴定为灰绿曲霉组谢瓦氏曲霉间型变种(A.Chevalieri var.intermedius Thom and Raper)。

利用抑制性差减杂交技术鉴定谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因

谢瓦氏曲霉间型变种Aspergillus chevalieri var.intermedius俗称"金花菌",是茯砖茶发酵中的优势菌种,该菌在不同的渗透压胁迫下产生不同类型的孢子。采用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),以低渗条件下产生的子囊孢子和高渗条件下产生的分生孢子为材料分别与营养菌丝体构建两个正反向文库。每个库随机挑选400个阳性克隆进行测序。然后将所得到的基因片段在GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,筛选出的差异表达的基因涉及蛋白质代谢、细胞代谢、转录调控等多个方面,其中可能参与有性产孢调控的基因有13条,可能参与无性产孢调控的基因有10条。

谢瓦氏曲霉间型变种esdC基因的功能分析

为了研究谢瓦氏曲霉间型变种esd C基因的功能,构建该基因的敲除载体,通过农杆菌介导转化及筛选获得敲除突变体,并对突变体的形态进行了初步分析。生物学特性显示:△esd C突变子的子囊结构与野生型相似,子囊孢子均为球形或近球形,无性发育也与野生型无显著差异。但是,在MYA培养基上培养14d后,△esd C突变体菌落的渗出液相对野生型较少,且无皱褶,菌落表面干燥。这些结果表明esd C基因的缺失对孢子结构的影响不显著,为谢瓦氏曲霉间型变种有性调控机制的研究奠定了技术基础。