黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法，从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2—111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶，经SDS—PAGE验证，该酶纯化水平已达到电泳纯．该酶的表观分子量（Mr）约为47×10^3，最适pH值为3．0，pH稳定性范围为2．5—6．0，最适温度为50℃，温度稳定性范围为30—60℃；Cu^2＋、Mn^2＋对其有激活作用，Hg^2＋、Ag^＋对其则有轻度的抑制作用；该酶的氨基酸组成为：中极性酸性氨基酸占17．29％，极性碱性氨基酸占4．50％，极性中性氨基酸占38．50％，其它为非极性氨基酸；N端氨基酸序列为SKGSAVTFPQ，经序列同源性比对，表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性．

黑曲霉Aspergillus niger H菌株所产酸性蛋白酶的质谱法鉴定及酶学特性

采用质谱指纹（MS mapping）分析方法,直接对黑曲霉Aspergillus niger H菌株发酵液中所产蛋白进行鉴定,通过与质谱数据库比对分析,确定此蛋白为曲霉酸性蛋白酶Aspergillopepsin I（EC.3.4.23.18）。对其酶学性质的研究表明,此蛋白酶分子量约为47kDa,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30-50℃,最适pH为3.0,pH稳定性为2-5,其表征与其它已报道的曲霉酸性蛋白酶基本一致,证实此质谱指纹分析方法可快速有效地鉴定混合发酵液中的未知蛋白,并省去中间繁琐的分离纯化步骤。

高产酸性蛋白酶白曲霉培养条件的优化研究

以实验室保藏的白曲霉菌株为目标菌株,从生长条件、产酶活力的关键工艺因素进行研究分析,以提高白曲霉菌株酸性蛋白酶活力为目的,探究高产酸性蛋白酶白曲霉的实验室最佳培养条件。研究结果表明,以麸皮为主要原料,培养基水分添加量为100%,培养基pH值为5,培养温度38℃,培养时间72 h,为该实验菌株的实验室最佳培养条件。

黑曲霉固态发酵餐厨垃圾生产酸性蛋白酶

餐厨垃圾作为餐饮行业中的大宗废弃物,目前主要是进行填埋处理,既浪费了资源又不利于环保。采用黑曲霉固态发酵餐厨垃圾生产酸性蛋白酶,为这一资源的综合利用开辟了新途径。通过单因素试验考察了黑曲霉接种量、培养基含水量及发酵时间3个重要因素对固态发酵餐厨垃圾生产酸性蛋白酶的影响。在单因素试验基础上,采用正交试验优化产酶工艺参数。结果表明,30 g餐厨垃圾固态发酵培养基中,黑曲霉接种量4 mL,加水量22 mL,30℃发酵70 h,此工艺条件下所得酸性蛋白酶的活力最高。

霉菌酸性蛋白酶高产突变菌株9169的选育

对一株宇佐美曲霉进行紫外光、微波和60 Co的逐级诱变育种 ,使酸性蛋白酶产量从 2 80 0U/mL提高到 72 0 0U/mL .突变株传代多次 ,产酶性能保持稳定 ;对突变株与出发株的发酵过程进行了比较研究 ,发现突变株最大产酶时间提前 10h以上 ,而培养基

微波诱变结合化学诱变选育酸性蛋白酶高产菌

酸性蛋白酶是酶制剂工业比较重要的酶种，广泛应用于饲料、食品、皮革、医药和酿造工业中［１～４］，具有较大的市场潜力。本研究以宇佐美曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｕｓａｍｉ）白色突变株Ｂ１为出发菌株，通过微波诱变和亚硝基胍、硫酸锂复合诱变剂点试平板法诱变，选...

酒用酸性蛋白酶的研究进展

酒用酸性蛋白酶在白酒酿造的发酵过程中起协同作用,具有溶解发酵原料的颗粒、促进微生物繁殖、分解蛋白质生成香味物质、降解酵母菌体蛋白等多种功能。综述了酒用酸性蛋白酶酶源研究及其酿酒中的酶学功能。

黑曲霉HU53菌株产酸性蛋白酶的条件和酶学性质

本文报道了黑曲霉(Aspergillus niger)HU53菌株产酸性蛋白酶的固体发酵条件优化和酶学特性的研究结果。适合该菌株的最佳固体发酵培养基为麦麸38.8%,豆粕9.7%,NH4NO3 1.5%和水50.0%,最佳起始pH5.5。在28℃下发酵50h后酸性蛋白酶的比活力达到93.8 U/g,且在52h发酵期内基本不产孢子。该酸性蛋白酶的最佳反应酸碱度为pH3.0,最佳反应温度为50℃,对酪蛋白的Km为2.8016 mg/ml,在40℃下保温180min后相对酶活力为93.50%。2.0 mmol/L的Cu2+和Mn2+对该酸性蛋白酶具有极其显著的激活作用,相对酶活力分别为对照的171.9%和121.1%;而相同浓度的Fe3+和Ca2+则对其表现出强烈的抑制作用,相对酶活力分别仅为对照的62.5%和44.6%。

复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株

以米曲霉M-2为出发菌株,通过紫外线-氯化锂和硫酸二乙脂(DES)复合诱变,筛选酸性蛋白酶高产突变株,并进行固态发酵筛选试验。从大量突变株中进行筛选,获得1株遗传性稳定的酸性蛋白酶高产突变株D-7,其酶活力由出发菌的262.7U/g提高至602.5U/g,提高了129.3%。

米曲霉高产酸性蛋白酶菌株的选育

用2%的纤维素酶,35℃下水浴酶解3 h制得米曲霉部分去壁孢子,以它为诱变对象对其进行Licl-微波,DES-超声波复合诱变,并利用酪蛋白平板初筛,三角瓶固体培养测酶活复筛。最终选出1株高产酸性蛋白酶的菌株C2,其产酸性蛋白酶活力是原始菌株的135.0%。

白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中表达

研究分析固态发酵酸性蛋白酶生产菌株及其产品,ITS序列鉴定结果表明,该菌株为曲霉属,质谱分析结果表明其产品为Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I（EC.3.4.23.18）。根据Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I基因序列pep1（GI：473517）设计引物,以固态发酵酸性蛋白酶生产菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得pep1基因。序列分析结果表明,扩增片段与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶基因组序列相似性为99%,其编码蛋白与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶（GAA90749.1）相似性为100%,将该基因命名为pep B。构建黑曲霉表达载体p SZHG-pep B,通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462,筛选得到在gla A位点发生同源重组纯合转化子。经摇瓶发酵后,对产物进行SDS-PAGE、酶活检测以及酸性蛋白酶酶学性质和酶稳定性研究。结果表明,纯合同源重组菌株经SDS-PAGE检测时在47 ku左右处有明显目的蛋白条带,其发酵产物酸性蛋白酶酶活达5 543 U·m L-1,为出发菌株152倍。对菌株所产酸性蛋白酶酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为50℃,最适反应p H 3.0,在4℃和25℃条件下,酶在p H 3.0~4.0时较稳定。

泸型大曲黑曲霉产酸性蛋白酶条件的优化及其酶学性质的研究

以泸型大曲中分离的黑曲霉为菌种,采用固态发酵来产酸性蛋白酶,以发酵产物中酸性蛋白酶酶活为指标,对菌种产酸性蛋白酶的发酵条件进行了优化,同时对所产酸性蛋白酶的酶学性质进行了研究,实验结果表明:当麸皮:豆粕=6:4、玉米粉2.0%(g/g)、NH4Cl浓度2.5%(g/g)、持水量95%(mL/g)、初始pH6.0,培养时间50h,培养温度28℃,接种量6.0%时,发酵产物酸性蛋白酶酶活达24350U/g,平均酶活比初始培养基提高64.6%。对菌株所产酸性蛋白酶酶学性质的研究得出:该酶最佳反应温度为55℃,最佳反应pH为3.5,温度50℃以下该酶较稳定,2mmoL/L的K+、Cu2+、Ca2+、Fe+、Ag+离子对该酶具有激活作用,而同浓度的Fe3+、Fe2+、Zn2+离子对该酶具有抑制作用。

响应面法优化酸性蛋白酶发酵条件的研究

采用响应面方法对黑曲霉(Aspergillus nigerSZ-357)产酸性蛋白酶的发酵条件进行了优化。首先通过全因子实验分析了温度、pH值、接种量、装液量对产酶的影响,确定主要影响因子为温度、装液量,前者为正影响,后者为负影响。用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,利用中心组合设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳水平。在优化的发酵条件下发酵3d,酶活达到1543.01U/mL。

黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表达与酶学性质解析

酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50℃以上或pH> 3. 0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIM F0510的酸性蛋白酶基因exp A在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组菌GS115 (p PIC-expA)。摇瓶发酵条件下,重组酶EXPA的酶活为257 380 RFU/h。生物信息学分析的结果显示,该酶属于天冬氨酸蛋白酶A1A家族。酶学性质的研究表明,该重组酶的最适反应温度和pH分别为50℃和3. 0;分别在40～50℃或pH 2. 5～3. 5孵育1 h后,仍能保留80%左右的活力。Zn^(2+)、Ca^(2+)、Fe^(2+)和Mn^(2+)对其活性有一定的促进作用;而Cu^(2+)、Co^(2+)、Fe^(3+)、EDTA和SDS则对其活性有显著的抑制作用。此外,重组酶EXPA对大豆分离蛋白、水溶性玉米蛋白和小麦水解蛋白均具有较好的水解作用。较好的耐热性和pH稳定性为EXPA在食品、饲料等领域的应用奠定了基础。

黑曲霉固体发酵产酸性蛋白酶条件优化

对经诱变后黑曲霉固体发酵生产酸性蛋白酶的培养基组成及发酵条件进行优化。结果表明,该菌发酵产酶的最适培养基和条件为米糠20 g,碳源玉米粉60 g/kg,氮源硝酸铵5 g/kg,MnCl2 4 g/kg,料液比1.0∶1.5,调初始pH值7,以6mL/100g的接种量接种,在40℃、180 r/min下发酵72 h,摇瓶产酶达到1 120.0 U/mL,比基础培养基提高了近2.9倍。

提高宇佐美曲霉537产酶活性的研究

通过控制斜面培养基成分和液体发酵的通气量提高宇佐美曲霉５３７产生的酸性蛋白酶活力。产酶活性提高了２０％左右。达到７１００单位／亳升。

大豆蛋白水解液脱苦的研究

大豆蛋白酶解常常会产生苦味,蛋白质水解物苦味肽的苦味是长期困扰其应用的问题。本文研究了酶法与微生物法对大豆蛋白水解液脱苦的效果。结果表明:采用端肽酶黑曲霉酸性蛋白酶(3000u/g)与内切酶枯草杆菌碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L)协同作用水解大豆蛋白可有效降低水解液苦味,并且由酿酒酵母对水解液进一步处理后,大豆蛋白水解液的苦味降至更低。

农杆菌介导pepA基因对黑曲霉菌丝体的遗传转化

通过重叠延伸PCR将宇佐米曲霉中1 347 bp的酸性蛋白酶基因pepA与黑曲霉糖化酶基因5'同源臂和3'同源臂进行拼接,构建pepA基因表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-pepA。将载体pSZH-pepA通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉菌丝体。以PDA作为共培养培养基,乙酰丁香酮(简称AS)浓度200μmol.mL-1的条件下,28℃恒温静置培养48 h,经潮霉素筛选和PCR鉴定获得3株重组菌株。以出发菌株作为对照,对3株重组菌株静置培养7 d后的发酵液上清进行酶活测定,结果发现酸性蛋白酶酶活最高达45.56 U.mL-1,而出发菌株的酸性蛋白酶酶活仅为3.72 U.mL-1,表明酸性蛋白酶基因pepA在高产糖化酶的黑曲霉中得到表达。研究建立了农杆菌介导的pepA基因导入黑曲霉菌丝体的转化体系,为实现酸性蛋白酶在黑曲霉菌丝体中高效表达奠定基础。

应用基因组改组技术选育米曲霉酸性蛋白酶高产菌株

以产酸性蛋白酶较高的菌株Y-9及F-5为出发菌株,对它们进行基因组改组,进行原生质体双灭活,以PEG作为融合剂,并对融合条件进行优化。试验表明:融合最佳条件为PEG 50%、pH 6.0、融合处理15min,此时融合率达到12%。通过第一及第二轮的基因组改组,最终得到产酸性蛋白酶较出发菌株Y-9高出了253.37%,较F-5高出了276.25%的米曲霉菌株G11。

黑曲霉黄色变株A-2580产耐温酸性蛋白酶发酵条件的优化

经筛选诱变得到一株产生耐温酸性蛋白酶的黑曲霉黄色变株 A-2 5 80 ,对其发酵条件进行了优化 :通过单因子试验和正交试验 ,确定其最适培养基为 (g/L) :麸皮 2 1 .6、豆饼粉 48.4、 NH4Cl 2、 KH2 PO40 .8,p H4～ 5 ,温度 3 0℃的条件下进行振荡培养 ,发酵 72 h,酶活可达 670 0 u/ml.