At2基因双T-DNA植物表达载体的构建

以甜瓜品种‘MR-1’为试材,采用PCR技术,扩增出了At2基因并在两端添加BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。结果表明:在NCBI上进行BLAST显示其氨基酸序列与GeneBank中已公布的At2基因的同源性为99%;经DNAMAN软件分析,核苷酸序列同源性为99.43%。将其连接在中间表达载体G-pPTN133上,得到替换了GUS基因的中间载体A-pPTN133。A-pPTN133再经ScaⅠ酶切后,插入到经ScaⅠ酶切的pPTN133^-中,构建成双T-DNA植物表达载体At2-pPTN133。经酶切和PCR鉴定证明了所构建载体的正确性。

新疆哈密瓜AT2基因的克隆及初步功能验证

本研究利用RT-PCR技术从抗霜霉病哈密瓜(Cucumis melo L.)品种MR-1中克隆到AT2基因,其整编码区为1 229 bp,编码401个氨基酸,同源比对结果为99%,将其编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶蛋白序列与多种物种进行系统进化树分析,结果显示,甜瓜与黄瓜SGT蛋白同源性较高,遗传距离最近,推测在同属中该蛋白进化相对保守。在线分析表明SGT蛋白不含信号肽及跨膜区,即该蛋白为非跨膜蛋白。RT-PCR分析表明AT2基因随着植株生长时期不同表达量不同,开花期表达量最高,幼苗期至开花期表达量呈上升趋势;且不同组织中,叶片表达量显著高于茎、根。构建了p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,运用农杆菌介导法转化烟草,抗性筛选获得7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,AT2基因在不同株系转基因烟草T0代中表达量均高于野生型。通过对转基因烟草进行抗病性鉴定,转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草。本研究表明,过表达AT2基因能够提高烟草对部分真菌性病害的抗性。

AT2R基因可调控表达对体外培养VSMC纤维黏连蛋白表达的影响

目的利用Dox-on可调控哺乳动物表达系统,建立起了受四环素类似物Doxycycline(Dox)紧密调控、表达AT2R基因的双重稳定血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC),在此基础上对纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)的表达受AngⅡ及其受体拮抗剂的影响进行研究。方法建立Dox可调控表达AT2R基因的双重稳定大鼠VSMC细胞,观察该VSMC细胞中AT2R受调控表达情况,以及血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)及其1型、2型受体拮抗剂干预上述细胞后FN的mRNA及蛋白表达情况变化。结果Dox-on可调控哺乳动物表达系统可成功介导AT2R基因在原代培养大鼠主动脉VSMC的表达,该表达受到Dox给予/去除的紧密调控;Dox干预可在48h内迅速诱导该VSMC细胞表达AT2R,AT2R表达在Dox干预后72h进一步增强(P<0.01)。AT2R基因的可调控表达抑制由于AngⅡ干预VSMC后引起FN表达的增强(P<0.01)。这一作用被AT1R拮抗剂CV-11974进一步增强(P<0.01);而被加入AT2R拮抗剂干预而取消;同时给予AT1R拮抗剂和AT2R拮抗剂时FN的表达与基础状态时的情况一致。结论AngⅡ干预增强FN的表达,该作用是通过AT1R介导的;经Dox诱导表达AT2R基因可以明显抑制这一生物学作用,说明在这一生物学效应上,AT2R具有与AT1R相拮抗的生物学功能。

腺病毒介导AT2R基因转染表达抑制肾间质纤维母细胞增殖

目的 探讨人肾间质纤维母细胞 (hRIF)转染表达血管紧张肽Ⅱ (AngII)受体 (AT2R)对其增殖的影响。方法 构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV AT2R) ,体外转染hRIF ,用RT PCR方法检测AT2RmRNA表达 ,流式细胞仪检测AT2R表达率 ,用细胞周期分析、分裂指数、MTT比色法和 5 溴尿苷 (BrdU)掺入法检测hRIF增殖。结果 构建的AdCMV AT2R体外转染培养hRIF表达率为 90 6 %。AT2R峰值表达时 ,其S期和G2 M期细胞比率从 31 7%降低到 13 9% (P <0 0 5 ) ,分裂指数从 37 4%降低到 9 6 % (P <0 0 1) ,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低 6 0 1%和 5 4 2 % (P <0 0 1)。结论 AT2R转染表达可显著抑制体外培养hRIF的增殖 。

人工改造甜瓜钾离子通道基因ΔAT2/MIRK转拟南芥的生理特性分析

K^+通道是介导植物K^+吸收转运的主要途径之一。甜瓜K^+通道MIRK对外源Na^+敏感,生物信息学分析其敏感位点可能位于孔区外(即S5-P-S6)。为了验证MIRK受Na^+抑制位点,本研究将拟南芥中不受Na^+抑制的同源K^+通道基因KAT2孔道区替换到MIRK序列上,生成人工改造甜瓜K^+通道基因ΔAT2/MIRK。电生理实验结果显示ΔAT2/MIRK仍保持了MIRK介导K^+的属性,但其内向电流则不受外源Na^+的抑制。将MIRK和ΔAT2/MIRK分别转化到拟南芥K^+通道KAT1突变体kat1中,抗性筛选和PCR检测结果表明成功获得p35S::MIRK-kat1和p35S::ΔAT2/MIRK-kat1转基因植株。分别用50、100mmol/L的NaCl溶液处理转基因拟南芥和kat1突变体,发现MIRK及ΔAT2/MIRK在kat1中的过表达可以介导K^+内流,并参与植株对盐胁迫的响应。

大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响

目的 探讨腺病毒载体介导的大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法 应用带有绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体将大鼠AT2R基因转移至颈动脉球囊损伤模型中,2 1d后取材,应用免疫组织化学方法检测AT2R在动脉壁中的表达,图像分析观察其对新生内膜形成的影响。结果 在体大鼠颈动脉腺病毒载体的转染率达4 0 % ,AT2R基因在血管壁的新生内膜、中膜、外膜稳定表达,转染AT2R基因的球囊损伤后颈动脉与绿色荧光蛋白基因对照组相比,血管新生内膜 中膜面积比降低了4 8%。结论 AT2R基因转染可抑制颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成,对血管成形术后再狭窄可能有一定的预防作用。

宁夏回族人群AT2R基因多态性与原发性高血压的相关性研究

目的:探讨宁夏回族人群AT2R基因多态性与原发性高血压的相关性。方法:选择在本院内科诊治的宁夏回族人群原发性高血压患者150例作为观察组,同期选择150名血压正常者作为对照组,应用片段长度多态性PCR方法检测AT2R^(C3123A)位点基因多态性。结果:两组性别、年龄、体质量指数、血糖等对比无显著差异(P>0.05),观察组的收缩压、舒张压显著高于对照组(P <0.05)。两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05),AT2R^(C3123A)位点的三种基因型CC、AA、CA在观察组、对照组之间的频率分布差异有统计学意义(P <0.05)。结论:宁夏回族人群AT2R基因多态性与原发性高血压有一定的相关性,AT2R^(C3123ACA)基因型的增加可导致高血压发生率增加。

一种快速筛选转抗霜霉病基因甜瓜种子的方法研究

以用花粉管通道技术转入抗霜霉病基因At2的甜瓜T1代转基因种子为试材,采用组培技术得到膨大的外植体,利用PCR技术对组培得到的外植体进行检测,以期尽快筛选出阳性植株。结果表明:在甜瓜外植体培养过程中,筛选到的种子最佳灭菌条件为72℃、干灭4h,抑菌效果最好的培养基组分是MS无机盐+B5维生素+2mg/L 6-BA+7g/L琼脂+500mg/L头孢噻肟钠+1.1g/L甲基托布津;对1 100个转抗霜霉病基因At2的T1代种子外植体进行PCR检测,阳性率为4.5‰。

AT2受体基因1675A／G多态性对吲达帕胺缓释片在女性降压中疗效研究

目的探讨原发性女性高血压患者的AT2受体基因1675A／G多态性与吲达帕胺缓释片降压疗效的相关性。方法用吲达帕胺缓释片（1．5mgl次／d），对220例原发性女性高血压患者进行为期8周的降压治疗，用聚合酶链反应（PCR）、高分辨率熔解曲线（HRM）及基因测序方法检测患者的AT2受体基因多态性。结果205例患者完成了试验，在女性患者中基因型AA、AG和GG应用吲达帕胺缓释片有效率分别为70．6％、71．6％、71．4％，三者比较差异无统计学意义（x2=2．53，P=0．49）；收缩压及缩张压降低幅度比较差异亦无统计学意义（F值分别为0．39、0．19，P均〉0．05）。结论AT2受体基因1675A／G多态性可能对吲达帕胺缓释片在女性患者降压疗效中不存在影响。

4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯在拟南芥中的作用位点研究

为了探究4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的除草作用方式,在前期蛋白组学研究结果的基础之上,对4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的潜在除草靶标基因进行筛选。利用实时定量PCR(RT-qPCR)技术,测定茎叶喷施质量浓度为1000 mg/L的4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯0,15,30,45 min后,拟南芥野生型株系和6种T-DNA插入株系的拟南芥中AT2G43030和AT1G66240基因的相对表达量,并比较拟南芥野生型株系和6种T-DNA插入株系的受损程度,分析AT2G43030和AT1G66240基因在4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯除草过程中的作用。结果表明:相比野生型拟南芥株系而言,AT2G43030和AT1G66240基因的6种T-DNA插入纯合株系对4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯更为敏感,茎叶喷施4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯24 h后不同T-DNA株系的叶片损伤程度相较野生型株系受损更为严重,证明AT2G43030和AT1G66240基因与拟南芥对4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的防御系统有关,同时也说明4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的除草作用机制与植株的光合作用和细胞膜功能有关。

醛固酮对高糖状态下肾小球系膜细胞血管紧张素Ⅱ受体基因表达的影响

血管紧张素Ⅱ能通过其1型受体（AT1R）和2型受体（AT2R）途径活化NF—κB，诱导单核细胞趋化蛋白1（MCP—1）表达12I，导致炎性反应。而醛同酮（ALD）是否也有类似的作用，尚未阐明。由于ALD能通过作用于肾脏周有细胞参与肾脏的损伤。因此，本实验通过研究ALD对高糖状态下大鼠肾小球系膜细胞（RMC）上AT1aR和AT2R基因表达的影响，探讨ALD在糖尿病肾病（DN）中的作用机制。