AtSARK互作蛋白的筛选与鉴定

植物LRR型类受体蛋白激酶在植物生命活动中发挥着重要作用。前期研究发现了一个通过生长素和乙烯的协同作用参与拟南芥叶片衰老过程正调控的类受体蛋白激酶,AtSARK。为深入研究AtSARK蛋白的作用机制,文章采用酵母双杂交系统,以AtSARK胞内域(AtSARK-CD)为诱饵蛋白,对拟南芥均一化cDNA文库进行筛选,得到83个AtSARK的候选互作组分,经过复筛,初步发现AtSARK的互作组分包括14-3-3蛋白、FKBP-型肽脯氨酰顺反异构酶、醛缩酶超家族成员、RING/U-box超家族成员以及WRKY转录因子家族成员。我们对其中一个功能未知的醛缩酶家族基因AtFBA5(AT4G26530)的表达模式进行了分析,并用GST pulldown实验证实了AtSARK-CD与AtFBA5间存在直接的相互作用。AtSARK互作组分的文库筛选及AtFBA5的分离有利于进一步研究AtSARK基因在衰老信号通路中的作用机制。

AtSARK关键自磷酸化位点Tyr-350的点突变及其功能分析

本实验室前期在拟南芥中发现了一个可以正向调控叶片衰老的LRR型丝/苏氨酸和酪氨酸双底物特异性类受体蛋白激酶At SARK(Arabidopsis thaliana senescence-associated receptor-like kinase),并且经软件预测和质谱分析发现其有多个自磷酸化位点。本文把其中位于C末端的一个自磷酸化位点Tyr-350分别突变为谷氨酸(E)以模拟磷酸化状态或突变为苯丙氨酸(F)以模拟非磷酸化状态,用诱导型启动子GVG系统来控制点突变的At SARKm的表达,然后以表达水平与正对照GVG:At SARKwt相近的转基因株系为实验对象,分别观察不同点突变对转基因拟南芥成苗和幼苗表型的影响,同时检测一些衰老相关标识基因的表达,从而研究Tyr-350自磷酸化状态变化对At SARK功能的影响。实验结果显示,对Tyr-350位点进行模拟磷酸化点突变会减弱过表达At SARK引起的早衰,而该位点模拟非磷酸化点突变则不会影响At SARK的功能。这些结果暗示着C末端磷酸化可能对At SARK的功能起抑制作用,而Tyr-350是其中一个重要调节位点。

PSA2在SSPP介导的衰老信号传递路径中的作用

利用半定量PCR实验证明了PSA2在叶片衰老过程中表达下调,同时发现psa2-1突变体较野生型早衰,并且荧光定量PCR显示其衰老相关标识基因均表达上调。另外,还利用酵母双杂交技术和植物体内双分子荧光互补技术验证了PSA2全长蛋白或不含信号肽的成熟蛋白均能与SSPP发生直接互作。本研究证明PSA2为叶片衰老的负调节因子且为AtSARK和SSPP介导的衰老信号传递路径的重要组分,为深入解析AtSARK和SSPP介导的叶片衰老分子机制奠定了基础。