R-(α)-甲基组胺对AtT20垂体瘤细胞Pomc及其转录因子表达的影响

[目的]研究R-(α)-甲基组胺[R-(α)-MeHA]对AtT20垂体瘤细胞Pomc及其转录因子表达的影响。[方法]以小鼠垂体瘤细胞(AtT20)为实验对象,分别采用0.02~12.5μmol/L R-(α)-MeHA干预AtT20细胞24h,通过MTT检测药物对细胞增殖的影响;采用0.1μmol/L R-(α)-MeHA干预AtT20细胞30min、1、2、4、8、12h等相应时间,运用ELISA方法检测细胞分泌至培养液的促肾上腺皮质激素(ACTH)含量,RT-q PCR方法检测相关基因mRNA表达,Western blot方法检测相关蛋白表达。[结果]0.02~12.5μmol/L的R-(α)-MeHA对AtT20细胞的增殖无抑制作用更无毒性作用。0.1μmol/L R-(α)-MeHA对AtT20细胞ACTH分泌功能无明显作用。与对照组比较,0.1μmol/L R-(α)-MeHA干预AtT20细胞4h后,可增强阿片促黑素皮质素原(Pomc)基因表达、0.5μmol/L R-(α)-MeHA促进Pomc蛋白表达;此外0.1μmol/L R-(α)-MeHA干预AtT20细胞30min^12h不同时点后Pou1f1基因表达均显著上调,其中以4h最为明显,上调达3倍(P<0.05);同样,0.1μmol/L R-(α)-MeHA作用4h也显著促进Egr1基因表达上调约2倍(P<0.05);作用1h显著增强了Prop1基因表达,上调近4倍(P<0.05);干预4h、8h均显著上调Foxl2基因表达,上调约3倍(P<0.05),对Neurod1、Pitx1和Tbx19基因表达无明显影响。[结论]R-(α)-MeHA具有促进Pomc基因以及其转录因子Pou1f1、Egr1、Prop1和Foxl2的表达作用。

组胺H_3受体对垂体瘤AtT-20细胞分泌ACTH的调节作用

目的 观察组胺受体激动剂对 At T- 2 0细胞分泌ACTH的影响 ,并探讨 G蛋白在组胺 H3受体信号转导机制中的作用 .方法 选用文献报道的高表达组胺 H3受体的垂体细胞瘤 At T- 2 0作为观察系统 ,用放免分析法测定给予组胺受体激动剂后各时间点细胞上清液中 ACTH分泌量的变化 ,并观察药物对细胞增殖的影响 .结果 组胺 H3受体激动剂R- (α) - Me HA(0 .1μmol· L- 1 )作用 8h能明显促进 ACTH的释放 ,释放量为 192 0 μg· L- 1 ,与同时间对照组 (780 μg·L- 1 )相比 ,明显增高 (P<0 .0 1) ;H1 和 H2 激动剂则无此作用 .且 R- (α) - Me HA引起 ACTH分泌的效应能被 H3受体特异性拮抗剂 thioperamide所拮抗 ,而 H1 受体和 H2 受体拮抗剂均不影响 R- (α) - Me HA的效应 .R- (α) - Me HA作用 8和 2 4h,对细胞增殖无明显影响 .用 G蛋白失活剂 NEM预先处理细胞后 ,取消了 R- (α) - Me HA增强 At T- 2 0细胞 ACTH分泌的效应 .结论 特异性激动组胺 H3受体后能引起兴奋 -分泌耦联过程 ,其信号转导过程中有 G蛋白的参与 .

MSP58低表达对垂体瘤细胞AtT-20增殖、侵袭和迁移的影响

目的探讨核微球蛋白58(MSP58)低表达对垂体瘤细胞AtT-20增殖、侵袭和迁移的影响。方法体外培养人垂体瘤AtT-20、HP75、GH3、GT1-1细胞,Transwell法观察侵袭情况,将AtT-20细胞分为对照组(不转染)、NC-siRNA组(转染对照siRNA)和MSP58-siRNA组(转染针对MSP58的特异siRNA)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞中MSP58 mRNA表达情况,MTT法检测细胞增殖情况,Transwell法检测细胞侵袭、迁移情况,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞中MSP58、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达情况。结果AtT-20细胞侵袭细胞数均高于HP75、GH3、GT1-1细胞,故选择AtT-20细胞作为后续实验研究对象。对照组与NC-siRNA组AtT-20细胞中MSP58 mRNA表达水平,细胞增殖率,侵袭细胞数,迁移细胞数及细胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。与NC-siRNA组相比,MSP58-siRNA组AtT-20细胞中MSP58 mRNA表达水平,细胞增殖率,侵袭细胞数,迁移细胞数及细胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论下调MSP58表达可降低PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平,抑制垂体瘤细胞AtT-20的增殖、侵袭、迁移过程。

G蛋白介导组胺H_3受体调节垂体瘤At T-20细胞分泌ACTH

目的探讨G蛋白在组胺H3 受体信号转导机制中的作用。方法以高表达组胺H3 受体的垂体细胞瘤AtT 20作为观察系统 ,用放免分析法测定给予H3 受体激动剂后各时间点细胞上清液中ACTH分泌量的变化 ,并观察药物对细胞增殖的影响。结果组胺H3 受体激动剂R (α) MeHA(10 -7mol/L)作用8h ,能明显促进ACTH的释放 ,H1、H2受体激动剂无此作用 ,R (α) MeHA引起ACTH分泌的效应能被H3 受体特异性拮抗剂thioperamide所拮抗 ,而H1 受体和H2 受体拮抗剂均不影响R (α) MeHA的效应。用G蛋白失活剂NEM预处理细胞后 ,取消了R α MeHA增强AtT 20细胞分泌ACTH的效应。结论特异性激动组胺H3 受体后能引起兴奋 分泌偶联过程 ,其信号转导过程中有G蛋白的参与。

miR-20a靶向PTEN调控垂体腺瘤细胞的增殖与侵袭

目的:探讨miR-20a对垂体腺瘤细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制。方法:培养垂体腺瘤细胞系GH3、HP75,采用RT-qPCR、Western blotting、双荧光素酶报告基因检测等方法,分析垂体腺瘤细胞系中miR-20a和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的表达相关性以及相互作用情况;采用CCK8和Transwell等方法检测miR-20a对垂体腺瘤细胞增殖和侵袭能力的影响,进一步考察对PTEN下游PI3K/AKT信号通路的影响。结果:miR-20a负调控PTEN的表达。体外细胞实验显示,与miR-20a类似物对照组相比,类似物组在垂体腺瘤细胞系GH3和HP75中细胞迁移细胞数量、细胞增殖相关蛋白PI3K、AKT、MAPK和侵袭相关蛋白E-cadherin、MMP2和MMP9的表达量均增高,差异均有统计学意义(P<0.01);与抑制物对照组相比,miR-20a抑制物组在GH3和HP75中细胞迁移细胞数量和各蛋白表达量均下降,差异均有统计学意义(P<0.01);双荧光素酶报告基因分析发现与miR-20a类似物对照组比较,类似物组PTEN-WT的活性降低(P<0.01)。结论:miR-20a在调节细胞的增殖和侵袭的过程中扮演非常重要的作用,因而影响了垂体腺瘤细胞的增殖和侵袭。它可能通过靶向PTEN,影响PI3K/AKT信号通路,参与垂体腺瘤的进程中。

miR-152靶向TCEAL5对小鼠垂体瘤细胞AtT-20的影响

[目的]探讨miR-152靶向TCEAL5对小鼠垂体瘤细胞AtT-20增殖、凋亡和侵袭的影响。[方法]小鼠垂体瘤AtT-20细胞培养转染后48 h进行实验,实验分5组:mimic NC组、miR-152 mimic组、si-NC组,si-TCEAL5组。用双荧光素酶报告基因检测miR-152与TCEAL5的靶基因关系,MTT法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Transwell法检测细胞侵袭数目,蛋白免疫印迹法检测各组细胞TCEAL5蛋白表达。[结果] miR-152对TCEAL5有潜在的结合位点,转染miR-152 mimic显著降低了AtT-20细胞裂解液中荧光素酶的相对活性(1.00±0.31 vs 0.62±0.11),表明miR-152与TCEAL5 mRNA存在靶向调节作用。miR-152 mimic组、si-TCEAL5组72 h AtT-20细胞光密度值均显著低于mimic NC组和si-NC组(1.32±0.09 vs 1.03±0.06;1.22±0.15 vs 0.94±0.01;P<0.05)。转染48 h后,miR-152 mimic组、si-TCEAL5组AtT-20细胞凋亡率分别显著高于mimic NC组、si-NC组(3.81±0.23 vs 33.25±6.02;4.16±0.53 vs 25.27±3.61;P<0.05)。与mimic NC组比较,miR-152 mimic组AtT-20细胞的侵袭能力显著降低(83.22±10.23 vs 43.35±9.02;P<0.05);与si-NC组比较,si-TCEAL5组AtT-20细胞的侵袭能力显著降低(85.16±7.53 vs 55.67±5.65,P<0.05)。与mimic NC组比较,miR-152 mimic组AtT-20细胞TCEAL5蛋白表达水平显著降低(0.51±0.03 vs 0.25±0.02,P<0.05);与si-NC组比较,si-TCEAL5组AtT-20细胞TCEAL5蛋白表达水平显著降低(0.55±0.03 vs 0.24±0.01,P<0.05)。[结论] miR-152通过与TCEAL5靶向结合,进而抑制垂体瘤细胞AtT-20增殖、侵袭并促进其凋亡。

POMC基因5′上游近端片段的转录调控作用初探

目的 建立阿片黑皮质素原 (POMC)基因 5′上游近端转录调控体系并初步探讨其作用特点。方法 采用 DNA重组技术构建一系列受大鼠 POMC基因 5′上游近端不同长度片段介导的荧光素酶报告基因质粒 ,以lipofectam ine 包裹质粒转染垂体 ACTH瘤细胞系 (At T2 0 ) ,然后测定荧光素酶活性。结果 成功地构建了含POMC基因 - 34 / +6 3bp、- 16 5 / +6 3bp、- 32 3/ +6 3bp和 - 480 / +6 3bp片段的 4种报告基因质粒 ,其荧光素酶相对表达活性分别为 1、2 .1± 0 .3、3.3± 0 .3和 3.7± 0 .5 ,阳性对照为 4.8± 0 .8。结论 POMC基因的核心启动子比较弱 ,提示 POMC基因可能存在多个转录起始位点 :At T2 0细胞中 POMC基因持续表达的近端组织特异性调控元件主要集中于 - 34 / - 16 5 bp范围内。