拟南芥AtWRKY33基因启动子的克隆及表达分析

以野生型拟南芥为材料,采用PCR技术克隆得到了拟南芥AtWRKY33基因起始密码子ATG上游1629 bp启动子序列,并利用该启动子驱动GUS基因在野生型拟南芥中表达,对获得的转基因拟南芥采用重金属Cd处理不同时间,进行GUS染色及定量分析。结果表明:AtWRKY33基因启动子与GUS融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达;拟南芥植株中的AtWRKY33基因在根中大量表达;定性与定量实验均显示经重金属Cd处理后的拟南芥幼苗中AtWRKY33基因随着时间增加而被显著诱导表达。说明该基因响应重金属Cd胁迫。

丹参SmWRKY33基因的克隆与表达分析

为了研究WRKY33基因在丹参非生物胁迫中的作用机制,以白花丹参为试验材料,对丹参转录组数据进行分析,挖掘出丹参WRKY33基因参考序列并设计特异性引物,利用基因克隆技术从丹参中克隆出WRKY33基因的全长cDNA,命名为SmWRKY33。对SmWRKY33基因进行生物信息学分析,同时利用荧光定量方法探究SmWRKY33基因在逆境胁迫下的表达模式。结果表明,SmWRKY33基因核苷酸长度为1 635 bp,编码544个氨基酸。生物信息学分析显示,SmWRKY33基因的理论相对分子量为60 835.66,等电点为7.00,定位于细胞核,不存在跨膜区及信号肽,SmWRKY33蛋白为不稳定亲水蛋白。亲缘关系显示,SmWRKY33与紫苏、芝麻、白花泡桐的WRKY33亲缘关系较近。密码子偏好性分析得出拟南芥真核表达最适应丹参SmWRKY33基因的外源表达。qRT-PCR结果表明,SmWRKY33基因在低温、高温、PEG、NaCl等逆境胁迫诱导下具有不同的表达模式,其中低温、NaCl能显著诱导SmWRKY33基因的高表达,说明该基因对温度调节、盐胁迫较为敏感,猜测其参与温度、盐胁迫调控反应机制。本试验首次从丹参中克隆出SmWRKY33基因,探讨了该基因在丹参逆境胁迫下的作用机制,旨在为培育丹参的抗逆新品种提供参考基因。

ADAM33基因T2位点多态性与支气管哮喘易感性的关联研究

目的研究解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)基因T2位点多态性与支气管哮喘易感性的关联性。方法选取2019年12月至2020年12月在该院就诊并接受治疗的支气管哮喘患者120例作为研究组,选择同期在该院体检的健康者120例作为对照组,采用等位基因特异性聚合酶链反应技术及DNA测序方法检测两组ADAM33基因T2位点多态性。结果研究组和对照组ADAM33基因T2位点3种基因型均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。研究组与对照组ADAM33基因T2位点基因型(AA、AG、GG)频率比较,差异均有统计学意义(χ^(2)=7.001,P<0.05)。ADAM33基因T2位点等位基因中,研究组A等位基因频率(15.42%)低于对照组(23.75%),差异有统计学意义(P<0.05)。ADAM33基因T2位点A等位基因频率增加可降低支气管哮喘患病风险(OR=0.875,P<0.05)。与中度支气管哮喘患者相比,危重、重度支气管哮喘患者ADAM33基因T2位点AG基因型频率差异无统计学意义(P>0.05),中度、重度、危重支气管哮喘患者ADAM33基因T2位点AG基因型频率高于轻度支气管哮喘患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。ADAM33基因T2位点AG基因型频率增加是影响支气管哮喘严重程度的高危因素(P<0.05)。结论支气管哮喘与ADAM33基因位点多态性存在关联:ADAM33基因T2位点与支气管哮喘易感性有关,ADAM33基因T2位点A等位基因频率增加可降低支气管哮喘的患病风险,ADAM33基因T2位点AG基因型频率增加是影响支气管哮喘严重程度的高危因素。

紫花苜蓿MsMYB33基因克隆、亚细胞定位及转录自激活检测

MYB(V-myb Avian myeloblastosis viral Oncogene Homolog)转录因子数量较多、功能多样,在植物的发育过程中起着十分重要的作用。为了探究紫花苜蓿(Medicago sativa)中MsMYB33基因的亚细胞定位及自激活特性,本研究从紫花苜蓿中克隆MsMYB33基因,该基因开放阅读框为1641 bp,编码多肽含有546个氨基酸。遗传进化树显示MsMYB33蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)中的CaMYB33蛋白同源关系最高。将MsMYB33与黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein,YFP)进行融合表达,结果显示:MsMYB33蛋白定位于细胞核。通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-MYB33酵母表达载体,并转化到Y2HGold酵母菌中。酵母自激活检测结果显示,MsMYB33具有自激活活性,进一步分析发现激活区域位于C端。本研究为进一步研究紫花苜蓿MsMYB33基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。

牛支原体贵州分离株P33基因的克隆及遗传进化分析

为了解牛支原体贵州分离株的遗传进化情况,对其P33基因进行PCR扩增,扩增产物克隆至pMD19-T载体,筛选阳性克隆质粒进行基因序列和同源性分析,构建遗传进化树。结果:牛支原体贵州株P33基因PCR产物长度约690 bp(命名为GZ-Mb),与湖北株HB0801、Hubei-1同源性为99.6%,且在同一进化分支。结论:牛支原体贵州株P33基因与湖北株同源性最高,亲缘关系最近。

白介素-33在阿尔茨海默病中的研究进展

随着老龄化社会的到来,阿尔茨海默病(AD)的发病率越来越高,给社会带来了巨大的负担。该疾病目前影响着全球5000多万人,预计到2050年将增加到1.52亿人。尽管其流行率高,但该病的致病机制尚未完全阐明,不能有效地预防和治疗,因此有必要寻找针对阿尔茨海默的新治疗靶点。白介素-33(IL-33)是一种重要的神经炎症因子,在哺乳动物大脑的各种组织和细胞中高度表达。在阿尔茨海默病中,IL-33通过促进淀粉样斑块清除,减少tau蛋白的过度磷酸化,增强小胶质细胞的吞噬活性,并影响突触可塑性来发挥保护作用,本文就IL-33在AD中的作用做一综述,为AD的治疗提供一些新思路。

AtWRKY45调控拟南芥耐盐性的机制初探

拟南芥AtWRKY45基因参与离子吸收及叶片衰老过程,而在响应盐胁迫中的作用尚不清楚。为研究AtWRKY45是否参与盐胁迫过程,检测盐胁迫下At WRKY45基因的表达,结果显示AtWRKY45受盐胁迫诱导表达。基于此,以拟南芥AtWRKY45突变体和过表达植株为研究对象,观察其在盐胁迫条件下的表型及检测相关基因表达。结果显示突变体植株相较野生型而言电导率更低、叶绿素含量相对值更高,说明突变体株系对盐胁迫更不敏感,而过表达株系趋势则相反,说明过表达株系对盐胁迫更加敏感。此外,NaCl处理使得胁迫相关基因(AtRD29A、AtCOR15A)在突变体植株中均被上调表达,在过表达植株中被下调表达,烟草瞬时表达实验显示表达AtWRKY45相较对照而言AtCOR15A的荧光强度显著下降,说明AtWRKY45能显著抑制AtCOR15A的转录激活活性。以上结果表明AtWRKY45负调控拟南芥对盐胁迫的抗性。研究初步解析了AtWRKY45调控植物耐盐性的功能,为分子育种解决作物对盐胁迫敏感问题提供候选基因。

老年COPD急性加重期病人血清IL-33/sST2轴表达及其对预后的预测价值

目的 研究老年COPD急性加重期(AECOPD)病人血清IL-33/可溶型生长刺激表达基因2蛋白(sST2)轴表达及其对预后的预测价值。方法 选取2020年6月至2023年6月北京怀柔医院收治的138例老年AECOPD病人作为研究组,另选取本院同时期就诊的138例老年COPD稳定期病人作为对照组。比较2组病人血清IL-33、sST2、IL-4、IL-10水平,并进一步将研究组病人根据预后情况分为预后良好组和预后不良组进行分析。采用Logistic回归分析老年AECOPD病人预后不良的危险因素,绘制ROC曲线分析血清IL-33、sST2、IL-4、IL-10水平对老年AECOPD病人预后的预测价值。结果 研究组血清IL-33、sST2水平高于对照组(P<0.05),IL-4、IL-10水平低于对照组(P<0.05)。研究组138例病人中9例(6.52%)失访,129例病人中30例(23.26%)预后不良。预后不良组血清IL-33、sST2水平及合并症个数≥2个占比高于预后良好组(P<0.05),病程长于预后良好组(P<0.01),IL-4、IL-10水平低于预后良好组(P<0.01)。Logistic回归分析结果显示,IL-33、sST2、病程、合并症个数≥2个均是老年AECOPD病人预后不良的独立危险因素(P<0.05),IL-4、IL-10是保护因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清IL-33、sST2、IL-4、IL-10水平联合检测预测老年AECOPD病人预后不良的AUC为0.864,均明显高于上述指标单独预测价值(P<0.05)。结论 血清IL-33、sST2、IL-4、IL-10水平在老年AECOPD病人体内表达异常,与老年AECOPD病人预后关系密切,且上述指标联合检测对老年AECOPD病人预后不良的预测价值更高。

拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在非生物胁迫条件下的表达分析

WRKY转录因子家族在调控植物逆境诱导反应、生长发育及其信号转导等方面起着重要的分子生物学功能。文章采用Northern杂交的方法,对拟南芥3个WRKY基因进行表达谱分析。结果表明:AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33受多种非生物逆境因子(温度因子、高盐、渗透胁迫和激素脱落酸)的影响,其中低温和高盐对AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33的诱导尤为明显,表明这3个AtWRKY基因可能在响应环境信号方面起着一定的作用。作为序列相似性较高的AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33对一些胁迫因子的表达模式呈现一定的相似性;但AtWRKY33受高温的抑制和低温的快速诱导,与另外两个基因的表达模式不同,推测它们对温度胁迫因子的反应存在差异。此外,对启动子序列的生物信息学分析发现,3个基因的启动子包含多个与非生物逆境反应相关的顺式作用元件。

小麦抗秆锈病基因Sr33的微卫星标记

小麦抗秆锈病基因Sr33对强毒力小种Ug99和我国多数小麦秆锈菌小种具有良好抗性。以感病品种McNair701和来源于Tetra Canthatch/Triticum tauschii的单基因系Sr33为亲本,选用我国流行的小种34MKG,对作图群体161个F2单株及其F2:3家系进行抗性鉴定分析,利用分离群体集群分析法对位于小麦1D染色体上的57对微卫星引物进行扩增多态性筛选。获得2对在亲本及F2抗、感群体间揭示多态性的共显性标记Xbarc152和Xcfd15,位于Sr33两侧,与目标基因的遗传距离分别为2.4cM和2.1cM。

IL-4R、IL-13、ADAM33基因多态性与中国皖南地区汉族人群支气管哮喘的相关性研究

目的:探讨IL-4受体基因Arg551Gln(rs1801275)、IL-13基因Arg130Gln(rs20541)、ADAM33基因T1(rs2280091)位点基因多态性与中国皖南地区汉族人群支气管哮喘的相关性。方法:采用病例-对照的方法,用聚合酶链反应及直接基因测序法比较116例支气管哮喘组与70例正常人对照组之间基因型、等位基因频率的差异。结果:哮喘组和对照组IL-4受体基因Arg551Gln位点和IL-13基因Arg130Gln位点的基因型和等位基因型频率的差异有统计学意义,ADAM33基因T1位点基因型哮喘组和对照组差异有统计学意义,等位基因型频率在哮喘组和对照组差异无统计学意义。结论:提示IL-4R Arg551Gln(rs1801275)位和IL-13基因Arg130Gln(rs20541)位的多态性可能与中国皖南地区汉族哮喘有相关性;ADAM33基因(rs2280091)T1位点位的多态性可能与中国皖南地区汉族哮喘无相关性。

小冰麦33苗期抗叶锈性鉴定及其抗性基因推导

为明确小冰麦33在抗叶锈病方面的应用前景,选用了来自全国21个地区不同年份的214株叶锈菌株对小冰麦33进行苗期抗叶锈性鉴定。结果表明,在214株菌株中,只有云南与贵州两地区各出现了一个使其产生高侵染型的菌株,说明小冰麦33对我国小麦叶锈菌具有较强的苗期抗病性,可在我国大部分麦区使用。试验选用19个具有较好鉴别能力的小麦叶锈菌株和49个已知的抗叶锈单基因品系对其进行了抗叶锈基因推导,推导出小冰麦33中可能含有Lr2a、Lr3a、Lr23、Lr44及未知抗叶锈基因。

诸葛菜(Orychophragmus violaceus)Toc33基因编码区的克隆及序列分析

以诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)新鲜嫩叶为材料提取总DNA,并以其为模板,根据已报道的拟南芥(Arabidopsisthaliana)Toc33基因的编码序列,设计一对PCR引物,扩增诸葛菜叶绿体外膜蛋白转运器构件蛋白基因Toc33,得到两条扩增带,将这两条带分别割胶回收,与T载体连接转化E.coli,筛选重组子并测序,结果表明克隆到的这两个片段分别长1475bp,1573bp,通过同源性比较发现,它们之间的同源性达到88%.这两个片段与拟南芥Toc33基因有较高的同源性,分别命名为OvToc33 1,OvToc33 2.参考拟南芥Toc33外显子和氨基酸序列,分别确定了所克隆的两个诸葛菜Toc33基因片段的7个外显子和6个内含子,得到了诸葛菜Toc33基因的全编码区序列,并推导了其氨基酸序列.这两个DNA序列与拟南芥Toc33基因编码区的同源性分别高达91.8%和92.4%,说明这一蛋白是高度保守的.

胰腺癌中p33^(ING1b)基因变化及其表达研究

目的 检测胰腺癌中p33ING1b蛋白表达及基因变化情况,以了解p33ING1b在肿瘤发生过程中的作用。方法 采用免疫组化、聚合酶链反应单链构象多态性技术(PCR SSCP)和杂合型缺失(LOH)技术,检测胰腺癌中p33ING1b表达及p33ING1b基因变化情况。结果 ING1b蛋白的阳性表达率为85% (34/40),SSCP显示在40例病例中仅1例突变,LOH率为60.9% (14/23)。结论 突变与缺失表达并不是p33ING1b的主要失活形式,染色体改变可能导致p33ING1b功能下降,从而引发肿瘤发生。

ADAM33基因Q-1、T2位点基因多态性与新疆维吾尔族人群慢性阻塞性肺疾病的相关性

目的探讨ADAM33基因的Q-1、T2位点单核苷酸多态性(SNP)与新疆维吾尔族人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病的相关性。方法对107例新疆维吾尔族COPD患者和140例新疆维吾尔族健康体检者,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)分析ADAM33基因Q-1位点和T2位点的基因表达多态性。结果 (1)与对照组比较,COPD组T2位点基因型分布和等位基因频率分布差异有统计学意义(均P<0.05)。相对于GG基因型,AG+AA基因型能够降低COPD发生的风险〔OR(95%CI):0.536(0.293~0.983)〕。(2)单体型H4(GG)、单倍体H3(GA)和COPD存在相关性(均P<0.05)。(3)在COPD组T2位点GG基因型、AG+AA基因型的第一秒用力呼气容积占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)、第一秒用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1占预计值)差异无统计学意义(均P>0.05)。结论在新疆维吾尔族人群中,ADAM33基因T2位点基因多态性可能与COPD发病相关。

广西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G多态性的分布特点

目的:研究探讨IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因多态性在广西人群中的分布特点。分析两位点的基因型及基因频率在不同种族间的分布差异。方法:采用单碱基延伸法(PCR-SEB)及DNA测序法对283例受试者IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G位点进行多态性分析。用统计学方法分析其分布频率及组间差异。结果:rs10975521A/T存在AA、AT、TT三种基因型,分布频率分别为12.7%、53.0%、34.3%。其各基因型及等位基因频率在广西人群中男女性别之间无显著差异(P>0.05)。其等位基因频率与人类基因组计划公布的欧洲人(P<0.05)、北京汉族人(P<0.05)及日本人群(P<0.01)之间均有显著差异。rs1929992A/G存在AA、AG、GG三种基因型,分布频率分别为23.9%、53.7%、13.4%。其各基因型及等位基因频率在广西地区人群中男女之间也无统计医学意义(P>0.05)。其基因型与欧洲人(P<0.01)、北京汉族人(P<0.05)和日本人(P<0.01)之间差异有统计学意义。等位基因频率与欧洲人(P<0.01)、北京汉族人(P<0.05)相比差异有统计学意义。结论:IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因多态性在种族和地区间存在不同程度的差异。

牛瑟氏泰勒虫P23和P33表面蛋白双基因融合表达载体的构建及原核表达

为探索牛瑟氏泰勒虫的表面蛋白基因融合产物作为双价疫苗的可行性,以牛瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板,通过重叠延伸拼接聚合酶链式反应(SOE-PCR)把P23和P33表面蛋白基因连接一起,2个基因之间插入一个linker(Gly4Ser)3,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得1151bp的双基因融合片段,克隆于表达质粒pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-P23-P33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小70.0ku的融合蛋白。Western blot检测结果显示,该蛋白与牛瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究此融合蛋白作为疫苗候选成分提供了理论依据。

中国华南地区汉族人群支气管哮喘患者ADAM33基因T_1位点多态性研究

目的检测ADAM33基因T1位点多态性在中国华南地区汉族人群中的分布频率，探讨T1位点多态性与支气管哮喘的相关性。方法采用聚合酶链反应和限制性片断长度多态性及DNA测序的方法，对160例哮喘患者及95例健康人进行ADAM33基因T1位点多态性分析。结果在英国、美国、德国、韩国及中国华南地区的不同种族人群ADAM33基因T1位点等位基因频率的比较Х^2=9．085，P=0．059，差异无显著性。ADAM33基因T1位点3种基因型（TT、TC、CC）在哮喘组分布为129（80．6％）、27（16．9％）、4（2．5％），在对照组分布为90（94．7％）、3（3．2％）、2（2．1％），Х^2=10．955，P〈0．05，差异有显著性。哮喘组ADAM33基因T1位点等位基因T和C的频率分别为0．891、0．109；对照组ADAM33基因T1位点等位基因T和C分别为0．963、0．037。哮喘组与对照组T及C等位基因频率比较差异有显著性（Х^2=8．299，P〈0．05）。（4）进行单变量logistic回归探讨T1位点基因多态性与哮喘的关系，相对TT基因型而言，TC杂合型与TC＋CC均能显著增加哮喘发生的危险性，OR值（95％CI）分别为6．279（1．849-21．328）、4．326（1．620～11．550），P〈0．05。结论ADAM33基因T1位点基因多态性与中国华南地区汉族人群哮喘易感性相关。

ADAM33基因单核苷酸多态性与哮喘易感性关系的Meta分析

目的通过Meta分析探讨ADAM33基因S2(rs528557)、T1(rs2280091)、T2(rs2280090)、V4(rs2787094)位点多态性与中国支气管哮喘患者遗传易患性的关系。方法收集Pubmed、Web of sience、万方数据知识服务平台、中国知网(CNKI)等数据库中建库至2016年3月发表的有关ADAM33基因多态性与中国支气管哮喘易感性之间关联的文献,2名独立工作人员仔细评估所有研究,明确符合纳入标准的文献,提取每个研究中的信息,使用Stata12.1软件进行统计学分析。结果 Meta分析共纳入21篇病例-对照研究,包括哮喘病例3 918例和健康对照3 481例。S2位点和V4位点多态性与哮喘易感性无相关性;T1位点模型(A vs G)、(AA vs AG+GG)、(AA vs GG)与哮喘显著相关,为保护性因素;T2位点模型(AA vs AG+GG)与哮喘显著相关,为保护性因素。结论 ADAM33基因部分位点多态性与中国哮喘人群有一定的相关性。

ADAM33基因在慢性哮喘小鼠气道重塑中的表达

目的:研究ADAM33(a disintegrin and a metallo proteinase 33)mRNA在慢性哮喘小鼠模型气道重塑中的表达。方法:20只雌性C57BL/6小鼠随机分为2组,每组10只。A组(慢性哮喘组)分别于第1、14天小鼠腹腔注射1mL致敏液,从第21天开始雾化吸入2.5%的卵蛋白(OVA)溶液,每次30min,每周3次,连续8周。(2)B组(生理盐水对照组)给予生理盐水进行致敏和激发。在末次激发24h后,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)做细胞分类计数。用实时定量反转录多聚酶链反应(real-timeRT-PCR)法测定肺组织中ADAM33、白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)mRNA表达量。取左肺组织分别行苏木紫-伊红(HE)染色和Masson′sTrichrome染色,用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体行免疫组化染色。结果:A组BALF中嗜酸粒细胞[(6.3±1.3)×105/mL]及百分比[(18.1±3.0)%)]、肺组织中ADAM33、IL-4和IL-13等mRNA表达量[分别为(1.41±0.93)×10-2、(5.72±3.89)×10-2、(9.45±5.91)×10-2)]与B组相比明显增高(P<0.01)。而且Masson′sTrichrome染色示上皮下胶原纤维沉积增加、α-SMA免疫组化示气道平滑肌层明显增厚。结论:ADAM33 mRNA在小剂量OVA反复激发复制的慢性哮喘小鼠模型中表达增加,可能参与气道重塑的发生和发展。