番茄红素通过上调Beclin1-Atg 5通路激活自噬发挥对脊髓损伤大鼠的神经保护作用

目的探讨番茄红素对大鼠脊髓损伤后的神经保护机制。方法27只(6~8周龄)雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和实验组各9只。大鼠麻醉清醒后,实验组20 mg/kg番茄红素玉米油溶液灌胃,假手术组和模型组等体积玉米油灌胃,每天1次,共14 d。分别于术后1、3、7、14 d,采用斜板试验评估各组大鼠后肢运动功能变化;术后7 d,采用qRT-PCR和Western blot检测大鼠脊髓组织自噬相关因子Beclin1、Atg 5的表达水平。结果斜板试验结果显示,术后1、3、7、14 d模型组和实验组大鼠后肢运动功能低于假手术组(P<0.05);术后7、14 d,实验组较模型组大鼠后肢运动功能提高,差异有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量PCR(quantitative real-time,qRT-PCR)和蛋白质印迹法(western blot)结果显示,术后7 d模型组和实验组Beclin1、Atg 5的mRNA和蛋白质表达均较假手术组升高,实验组与模型组比较显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论番茄红素可能通过上调Beclin1-Atg 5通路激活自噬发挥对脊髓损伤大鼠的神经保护作用。

大黄鱼ATG5基因的分子特征及促进病毒增殖的作用

为探究大黄鱼自噬相关基因5(LcATG5)在病毒感染中免疫应答中的作用,本实验从大黄鱼中克隆得到了自噬相关基因ATG5(LcATG5),其开放阅读框(ORF)全长828个核苷酸,编码275个氨基酸的蛋白质,预测的分子量为32.3 ku,等电点为5.7。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,Lc ATG5与其他物种ATG5之间的序列一致性较高,含有1个高度保守的APG5结构域,并且与棘头梅童鱼ATG5的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,LcATG5在所检测的11个组织或器官中均有表达,在血液中表达量最高,在脾脏中表达量最低;LcATG5在来源于大黄鱼头肾组织的原代粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞以及细胞系LYCK细胞中也均有表达,在原代粒细胞中表达量相对较高,而在巨噬细胞中相对较低;病毒类似物poly(I:C)刺激后,这4种免疫细胞中LcATG5的表达水平都显著上调,其在LYCK细胞中变化最为显著,刺激后12 h上调了3.93倍。过表达Lc ATG5的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini,EPC)细胞受鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)感染48 h后,细胞病变效应(cytopathic effects,CPE)明显高于对照组,细胞培养上清中SVCV的滴度为10^(13.82)TCID_(50)/mL,高于对照组10^(9.27)TCID_(50)/mL,同时细胞内SVCV标志基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的表达量分别上调了13.77倍、15.72倍和11.39倍,表明Lc ATG5过表达促进了EPC细胞中SVCV病毒增殖,上述结果为深入研究自噬和自噬相关基因在鱼类病毒感染过程中的作用及机制奠定了基础。

敲除ATG5、ATG7基因对RPMI-8226细胞铁死亡敏感性的影响

目的:探讨ATG5、ATG7基因对诱导多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226细胞发生铁死亡的敏感性的影响。方法:用CRISPR/Cas9技术敲除RPMI-8226细胞株中自噬关键基因ATG5和ATG7;Western blot法鉴定基因敲除细胞并检测自噬相关蛋白P62、LC3B的表达变化;流式细胞术检测基因敲除细胞对RSL3敏感性的变化;检测基因敲除细胞内亚铁离子含量和活性氧水平。结果:Western blot检测结果证实RPMI-8226细胞中ATG5、ATG7基因被成功敲除。流式细胞术检测结果显示,RPMI-8226细胞存活率与不同浓度RSL3呈剂量依赖关系(r=-0.969);用10μmol/L的RSL3诱导对照组和基因敲除组细胞发生铁死亡,48 h后基因敲除组细胞存活率显著高于对照组(均P<0.001)。ATG5、ATG7基因敲除后细胞内Fe^(2+)的含量较对照组明显下降(均P<0.01),活性氧水平亦明显下降(均P<0.001)。结论:敲除ATG5、ATG7基因可以抑制多发性骨髓瘤细胞发生铁死亡,LAP途径可能参与其调控。

ATG5和VEGFR2在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

肝癌组织中ATG5的表达与临床病理(TNM)分期的关系,以及二者与肝癌TNM分期的关系。方法 本研究拟选择肝癌临床标本89份,按最大直径及TNM分期分为若干亚组,检测VEGFR2、ATG5蛋白及miRNA的表达,并进行关联研究。结果 VEGFR2、ATG5基因在癌组织中的阳性表达水平明显升高,且在瘤体直径≥50mm基TNMⅡ、Ⅲ分期及以上患者中更高。VEGFR2-miRNA、ATG5-miRNA在癌组织中表达更高。VEGFR2-miRNA、ATG5-miRNA、TNM分期成正向关联,ATG5-miRNA与TNM分期也同样如此。结论 肝癌组织中VEGFR2、ATG5的高表达与肝癌的恶性度及TNM分级相关,可得,VEGFR2、ATG5高参与肝细胞癌的发生、发展。

犀角地黄汤对脑缺血大鼠的自噬相关蛋白Atg-5、Be-clin-1表达的研究

目的探讨犀角地黄汤对内毒素诱导下持续性大脑中动脉栓塞模型(pMCAO)大鼠脑组织的自噬相关Atg-5、Beclin-1蛋白的mRNA表达,以及透射电镜下观察染色的LC-3抗体表达。方法造模后进行分组,并采用不同剂量犀角地黄汤进行干预,分别提取RNA、PCR检测Rat-atg-5、Beclin-1基因表达,透射电镜下观察染色的LC-3抗体表达。结果 "瘀热"证pMCAO模型大鼠中Atg-5、Beclin-1mRNA、模型组Atg-5和Beclin-1mRNA明显上升,犀角地黄汤中剂量治疗组和阳性药组与模型组比较均显著降低其表达。LC-3抗体染色颗粒提示,空白组表达不明显,模型组造模成功,尤其在第6天,模型组明显增多;阳性药组明显抑制LC-3的表达,第3和第6天到达最佳;低剂量组抑制效果不明显;中剂量组抑制效果好于高剂量组,第6天抑制效果最佳。结论犀角地黄汤通过显著的降低Atg-5、Beclin-1mRNA的表达,以及明显抑制LC-3的表达,能够起到脑保护的作用。

加味丹参饮预处理调控自噬相关基因Beclin-1和Atg5表达抗大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的探讨加味丹参饮预处理是否通过调节Beclin-1和Atg5表达调控自噬抗缺血再灌注损伤大鼠心肌。方法将60只健康SD大鼠随机分为空白对照(control group,C)组、假手术(sham,S)组、缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)组、IRI+加味丹参饮(Jiawei Danshen Yin,JDY)组、IRI+JDY+自噬抑制剂(inhibitor,I)组,每组12只。通过结扎-放松大鼠左冠状动脉前降支制备心肌IRI模型。通过氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察心肌梗死面积率;在透射电镜下观察自噬泡;采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测心肌Beclin-1和Atg5 m RNA表达;采用蛋白质印迹(western blot)法检测心肌Beclin-1蛋白表达变化。结果 IRI+JDY组心肌梗死面积率显著低于IRI组及IRI+JDY+I组(P<0.01)。电镜结果显示,IRI+JDY组适度调节大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞的自噬,改善心肌细胞结构。IRI组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较SG组显著升高(P<0.01);IRI+JDY组、IRI+JDY+I组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较IRI组显著降低(P<0.01);IRI+JDY组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较IRI+JDY+I组显著升高(P<0.01)。结论加味丹参饮通过调节缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞自噬相关基因Beclin-1和Atg5表达适度,调控缺血再灌注心肌细胞发生适度自噬,从而发挥细胞保护作用。

太平洋鳕ATG5基因的克隆及表达分析

ATG5(Autophagy related gene 5)基因是一种自噬相关基因,是形成自噬体的重要基因,ATG5基因的表达对自噬调控的成熟有重要作用。本研究中通过克隆,首次得到太平洋鳕Gadus macrocephalus ATG5c DNA部分序列,该序列长为895 bp,含有完整的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码275个氨基酸,其编码的蛋白质相对分子量约为32 200;经核苷酸序列比对发现,太平洋鳕ATG5核苷酸序列与半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis、尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus ATG5核苷酸序列的相似性均高达87.27%;利用太平洋鳕与其他物种ATG5核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,ATG5核苷酸序列系统进化树反映的亲缘关系基本符合传统分类学观点;氨基酸序列分析结果显示,ATG5蛋白氨基酸序列具有较高的保守性;利用绝对荧光定量PCR方法对ATG5基因在太平洋鳕各组织中的转录水平进行检测,结果显示,肝、脾和肾中的表达量高于其他组织,鳃、肾、脾、脑、肝和肌肉各组织中的ATG5 mRNA拷贝数分别为11.617 08、20.449 25、19.706 87、4.839 84、27.434 97、2.954 75 copies/ng。本研究结果将为进一步研究太平洋鳕细胞吞噬机制奠定基础,也为太平洋鳕的免疫机理和相关研究提供基础数据。

miR-181a及其靶基因Atg5在胃癌中的表达及临床意义

目的研究miR-181a及其靶基因Atg5在人胃癌细胞株和胃癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系。方法体外培养人胃癌细胞株(MGC-803、SGC-7901、BGC-823)和正常胃黏膜细胞株(GSE-1),收集30例胃癌血清和手术切除的癌组织及癌旁正常组织,并以30名正常人血清标本为对照,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测血清、细胞株、组织中miR-181a及细胞株、组织中Atg5 mRNA的表达情况。结果胃癌细胞株、组织、血液中miR-181a的表达较正常细胞、癌旁正常组织及正常人血清明显升高(P<0.05);Atg5 mRNA相对表达量在胃癌细胞株和胃癌组织中均分别低于正常胃黏膜细胞株和癌旁正常组织(P<0.05)。在胃癌组织和癌旁正常组织中,miR-181a与Atg5 mRNA表达呈负相关。结论 miR-181a在胃癌细胞株、胃癌组织和血清中显著高表达,提示其有望成为潜在的胃癌标志物。Atg5在胃癌中低表达并与miR-181a表达呈负相关,提示其可能是miR-181a在胃癌中的潜在作用靶基因。

肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠脊髓中自噬相关基因ATG5表达降低

目的明确自噬相关基因ATG5在肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)转基因鼠脊髓中的表达情况.方法取95d、108d和122d ALS转基因小鼠和野生型小鼠脊髓,应用免疫荧光、Western blot和RT-PCR技术,检测ATG5在脊髓中的表达.结果免疫荧光染色检测显示,在脊髓内,ATG5免疫反应产物主要定位于神经元;与同窝野生型小鼠比较,脊髓内ATG5免疫反应性在95d转基因小鼠无明显差异,而在108d和122d转基因小鼠明显降低.Western blot和RT-PCR分析显示,与同窝野生型小鼠比较,脊髓内ATG5 mRNA和蛋白表达水平在95d无明显变化,但在108d和122d时,转基因小鼠脊髓内ATG5 mRNA和蛋白表达均显著低于同窝野生型小鼠.结论ATG5在ALS转基因鼠脊髓中表达降低,提示ATG5表达异常与ALS发生密切相关.

自噬相关基因ATG5在感染和炎症性疾病中的作用

自噬对生物体维持细胞内环境具有至关重要的作用。目前已经证实自噬广泛参与多种疾病的发生发展过程,例如肿瘤、免疫性疾病以及炎症性疾病等,其与炎症性疾病相关性更加密切,也是近年来的研究热点。自噬相关基因(ATGs)参与调节自噬的许多方面,其中ATG5主要参与自噬小体的双层膜弯曲,对自噬的发生起决定性作用。本文主要概述近年研究发现ATG5在炎症性疾病中的机制,并探讨自噬其作为炎症性疾病治疗方向的可能性,为炎症性疾病的诊治提供新的思路。

rno-miR-30b-5p调控Atg5、Atg12和Becn1自噬基因表达在实验性自身免疫性葡萄膜炎中的作用

目的探讨rno-miR-30b-5p对Atg5、Atg12和Becn1自噬基因表达的调控作用及其在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)中的表达变化。方法 双荧光素酶检测mo-miR-30b-5p对Atg5、Atg12和Becn1自噬基因表达的调控作用。Lewis大鼠随机分为正常对照组和EAU组,每组各6只,EAU组诱导EAU模型,两组大鼠每天用Genesis-A眼底相机观察眼底情况。免疫后12 d,取眼球观察睫状体、视网膜的病理学表现;分离大鼠的脾脏和淋巴结,实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测rno-miR-30b-5p、Atg5、Atg12和Becn1 mRNA的表达情况;ELISA方法检测Atg5、Atg12和Becn1蛋白的表达水平。结果双荧光素酶检测结果证实Atg5、Atg12和Becn1为rno-miR-30b-5p调控的靶基因。免疫后12 d,EAU组大鼠眼底血管严重肿胀,病理学检测可见睫状体、视网膜内大量炎性细胞浸润。Q-PCR检测结果示,与正常对照组相比,免疫后12 d EAU组大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p mRNA水平分别为0.46±0.01和0.29±0.17,均呈下调表达(均为P<0.01);Atg5、Atg12和Becn1 mRNA水平均呈上调表达,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ELISA检测结果示,EAU组大鼠脾脏和淋巴结中Atg5、Atg12和Becn1蛋白表达水平均明显高于正常对照组大鼠(均为P<0.05)。结论 rno-miR-30b-5p可调控Atg5、Atg12和Becn1的表达。在EAU大鼠脾脏和淋巴结中,rno-miR-30b-5p的下调表达使Atg5、Atg12和Becn1基因和蛋白的表达水平均明显升高,从而影响葡萄膜炎的发展进程。

自噬相关基因ATG5沉默增加鼻咽癌裸鼠移植瘤的放射敏感性

目的通过构建自噬相关基因ATG5沉默的人鼻咽癌低分化鳞癌细胞(CNE-2细胞)裸鼠移植瘤模型,研究自噬与鼻咽癌放射敏感性的关系。方法选取24只裸鼠,随机分入对照组、NC组和ATG5组,每组8只。对照组裸鼠接种CNE-2细胞,NC组裸鼠接种转染阴性对照载体的CNE-2细胞,ATG5组裸鼠接种稳定沉默ATG5基因的CNE-2细胞。每组各取4只裸鼠给予10Gy射线照射,观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,并应用Western印迹法检测自噬相关蛋白ATG5和LC3Ⅱ的表达。结果自噬相关基因ATG5沉默的人鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤模型构建成功,成瘤率为100%。ATG5组的LC3Ⅱ、ATG5蛋白相对表达量显著低于对照组和NC组(P值均<0.05),ATG5+10Gy组也均显著低于对照+10Gy组和NC+10Gy组(P值均<0.05)。结论自噬相关基因ATG5沉默可以增加鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤的放射敏感性,推断自噬与鼻咽癌放射敏感性呈负相关。

加味丹参饮含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬相关基因Atg5和Beclin1 mRNA表达的影响

目的探讨加味丹参饮含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬及其相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达的影响。方法将体外培养的H9C2心肌细胞随机分为空白血清组(CG)、缺氧/复氧组(HRG)、加味丹参饮含药血清组(JDG)、JDG+自噬抑制剂(3-MA)组(JIG)、JDG+自噬激动剂(RAPA)组(JAG)。倒置显微镜观察各组心肌细胞生长及形态变化;MTT比色法测定心肌细胞存活率;透射电子显微镜观察心肌细胞自噬体形态及数量;实时荧光定量PCR检测自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达。结果与CG比较,HRG镜下心肌细胞变性坏死程度增加,细胞存活率下降(P<0.01),电镜下自噬体增多,实时荧光定量PCR示Atg5、Beclin1 mRNA表达上调;与HRG相比,JDG及JAG镜下心肌细胞变性坏死程度减轻,细胞存活率显著升高(P<0.01),电镜下自噬体增加,Atg5、Beclin1 mRNA表达进一步上调(P<0.05)。结论加味丹参饮预处理通过上调自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达,增强细胞自噬,保护缺氧/复氧损伤H9C2心肌细胞。

自噬相关基因Atg5的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆自噬相关基因Atg5,在大肠杆菌中重组表达后制备抗Atg5多克隆抗体。方法:用RT-PCR方法从RAW264.7细胞基因组中克隆Atg5基因,连接至pQE80L原核表达载体后转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定表达蛋白;目的蛋白纯化后,以100μg/kg纯化的蛋白免疫新西兰兔,制备抗Atg5多克隆抗体;提取RAW264.7细胞总蛋白,以制备的抗Atg5多抗进行Western blot反应,检测多抗的生物学活性。结果:克隆了Atg5基因,在大肠杆菌中表达了重组Atg5,SDS-PAGE分析显示表达产物相对分子质量与预期值一致,Western blot结果证明该产物具有较高的生物学活性,纯化蛋白免疫动物后制备了抗Atg5多克隆抗体。结论:在大肠杆菌中表达了重组Atg5,制备了抗Atg5多克隆抗体,为自噬的检测和研究提供了工具。

上皮性卵巢癌组织中ATG5、Beclin1与P53的表达及相关性研究

目的检测自噬相关基因ATG5、Beclin1与凋亡相关基因P53在上皮性卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织的表达情况,探讨其与卵巢癌发生、发展的相关性及意义。方法应用免疫组化SP法和RT-PCR技术检测25例正常卵巢、25例良性卵巢肿瘤及34例上皮性卵巢癌组织中ATG5、Beclin1、P53蛋白及mRNA的表达,并结合临床病理因素进行分析。结果 1ATG5、Beclin1的表达主要在细胞质内,P53主要表达在胞核内。ATG5、Beclin1在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织及卵巢癌组织中的表达阳性率两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。P53在卵巢癌组织中的表达阳性率与良性卵巢组织、正常卵巢组织相比,差异有统计学意义(P<0.01),而良性卵巢组织与正常卵巢组织表达阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。不同临床分期、病理分期的卵巢癌组织中ATG5、Beclin1及P53的表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关性分析显示,上皮性卵巢癌组织中ATG5与Beclin1蛋白表达呈正相关,ATG5与P53、Beclin1与P53蛋白表达均呈负相关(P<0.05)。2经RT-PCR检测,上皮性卵巢癌组织中ATG5、Beclin1的表达低于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织,良性卵巢组织低于正常卵巢组织,差异均具有统计学意义(P<0.05)。上皮性卵巢癌组织中P53的表达高于良性卵巢组织及正常组织(P<0.05),但良性卵巢组织与正常卵巢组织相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论上皮性卵巢癌的发病、进展可能与自噬相关基因Beclin1和ATG5自噬活性的抑制有关;自噬相关基因ATG5、Beclin1与凋亡相关基因P53在上皮性卵巢癌的发生发展中起拮抗作用,对其联合检测有利于了解和判断上皮性卵巢癌的进展程度、预后情况及指导治疗。

ATG5敲低后抑制人肺癌细胞H1299自噬并增强南蛇藤素诱导的细胞凋亡

目的构建自噬相关基因5(autophagy-related gene 5,ATG5)低表达肺癌细胞株,观察肺癌细胞自噬活性,检测南蛇藤素对肺癌细胞凋亡的影响。方法用ATG5 shRNA技术构建ATG5敲低的人肺癌H1299细胞株作为ATG5敲低组,未敲低ATG5的H1299细胞作为对照组;荧光定量PCR和Western blot检测肺癌细胞中ATG5的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)及死骨片蛋白1的(sequestosome 1,P62)表达,并转染红色荧光标记的LC3质粒观察LC3斑点聚集情况;经南蛇藤素刺激后,以流式细胞术检测细胞凋亡,最后使用Western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax等蛋白的表达。结果慢病毒感染组ATG5较对照组mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);ATG5敲低后LC3-Ⅱ水平下降,P62水平上升,并且转染后RFP-LC3斑点聚集减少(P<0.05)。相比对照组,南蛇藤素明显促进ATG5敲低细胞凋亡(P<0.01);ATG5敲低组中促凋亡分子Bax、cleaved caspase-3表达比对照组明显增加(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P<0.05)。结论 ATG5敲低抑制肺癌细胞自噬后,南蛇藤素能够明显增强人肺癌细胞的凋亡,提示抑制肺癌细胞自噬可能为针对性处理肺癌细胞耐药提供新的思路。

基于自噬基因Atg5和Beclin1探讨益气活血方对大鼠心肌缺血损伤的保护作用

目的探讨益气活血方是否通过调节自噬相关基因Beclin1和Atg5的表达调控发挥对心肌缺血的保护作用。方法将60只健康SD大鼠随机分成空白组、模型组、地奥心血康组、益气活血方高、中、低剂量组,通过腹腔注射异丙肾上腺素制备急性心肌缺血损伤模型。观察心肌梗死面积、心肌细胞超微结构,检测自噬基因Atg5、Beclin1 mRNA和凋亡基因Caspase-3 mRNA的表达。结果益气活血方高、中剂量组各项指标均明显高于模型组,益气活血方各剂量组大鼠心肌组织中Atg5、Beclinl mRNA表达量均升高(P<0.01或P<0.05),Caspase-3mRNA表达量降低(P<0.01或P<0.05)。结论益气活血方可以通过上调自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达,增强细胞自噬,下调Caspase-3mRNA表达,从而发挥对心肌缺血的保护作用。

大量摄入乙醇对大鼠海马区自噬相关蛋白ATG5及LC3Ⅰ/Ⅱ的影响

目的探讨大量乙醇灌胃1~4天大鼠海马区内自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ及ATG5表达的动态过程。方法利用连续大量灌胃给予乙醇1~4天建立大鼠模型,分别为对照组、D1、D2、D3、D4共5组。D1、D2、D3、D4组用乙醇(25%W/V,5 g/kg)灌胃,D1组大鼠给予乙醇灌胃1天,D2组大鼠给予乙醇灌胃2天,D3组大鼠给予乙醇灌胃3天,D4组大鼠给予乙醇灌胃4天。每8小时灌胃一次。对照组给予等体积纯净水灌胃。利用血液乙醇浓度测定试剂盒检测各组大鼠血液中乙醇浓度后,采用Western Blot技术检测各组大鼠大脑海马区LC3Ⅰ/Ⅱ,ATG5蛋白的表达情况并进行统计学分析。结果 D1~D4组大鼠血液乙醇浓度均大于300 mg/d L,说明大鼠均处于严重醉酒状态。D1~D4组大鼠海马区的LC3Ⅱ蛋白的相对灰度值分别为(0.63±0.03)、(1.30±0.07)、(1.26±0.07)和(1.24±0.07),与对照组(0.46±0.02)相比,D2、D3、D4组均显著性上调(P<0.001)。D1~D4组大鼠海马区ATG5蛋白的相对灰度值分别为(1.12±0.06)、(0.54±0.08)、(0.55±0.16)和(0.75±0.04),与对照组(0.60±0.07)相比,D1组显著性上调(P<0.01)。结论大量摄入乙醇过程中,大鼠均处于严重醉酒状态,乙醇可能通过上调大鼠大脑海马区的ATG5蛋白的表达激活自噬,从而增加自噬小体LC3Ⅱ的积累,是亚慢性乙醇脑损伤大鼠海马脑区自噬活性增强的可能机制之一。

稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块自噬相关蛋白Atg5和LC3B的影响

目的:观察搜风祛痰中药稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块自噬相关蛋白Atg5和LC3B的影响。方法:选取6周龄ApoE基因敲除小鼠,采用高脂饲料喂养的方法建立动脉粥样硬化(AS)不稳定斑块模型,并随机分为模型组,稳斑汤低、中、高剂量组,阿托伐他汀组;另取C57BL/6J小鼠设为空白对照组。模型组和空白对照组均给予0.9%生理盐水灌胃,稳斑汤低、中、高剂量组和阿托伐他汀组分别给予不同剂量的稳斑汤和阿托伐他汀片干预。13周后将小鼠麻醉处死,透射电镜下观察小鼠主动脉自噬小体,然后采用蛋白质印记(Western blot)法检测Atg5和LC3B蛋白表达水平。结果:透射电镜观察显示,空白对照组有少量自噬小体出现,模型组无明显自噬小体出现;与模型组相比,稳斑汤各剂量组和阿托伐他汀组的自噬小体数量均显著增多,其中阿托伐他汀组的数量最多。与空白对照组相比,模型组小鼠腹主动脉组织中Atg5和LC3B蛋白表达水平均降低(P<0.05);与模型组相比,稳斑汤各剂量组和阿托伐他汀组小鼠腹主动脉组织中Atg5和LC3B蛋白表达水平均升高(P<0.05)。结论:搜风祛痰中药稳斑汤可以明显提高ApoE基因敲除小鼠AS不稳定斑块自噬相关蛋白Atg5和LC3B的表达水平,这可能是稳斑汤影响动脉粥样硬化斑块稳定性的分子机制之一。

自噬相关基因Atg5与PTEN在前列腺腺癌中表达的相关性

目的探讨自噬相关基因5(autophagy gene 5,Atg5)与PTEN在前列腺腺癌(prostate cancer,PCa)中表达的关系,并分析二者表达的相关性。方法采用免疫组化SP法检测Atg5、PTEN在69例PCa及30例良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)组织中的表达。结果 (1)Atg5在BPH及PCa组织中的阳性率分别为6.67%(2/30)、88.41%(61/69),BPH组织中Atg5的阳性率明显低于PCa组织(P<0.01)。Atg5的表达与PCa Gleason评分分级无显著相关性(P>0.05)。PTEN在BPH及PCa组织中的阳性率分别为90.00%(27/30)、36.23%(25/69),BPH组织中PTEN的阳性率明显高于PCa组织(P<0.01)。(2)Atg5与PTEN在PCa中的表达呈负相关(χ2=7.9376,P=0.004 8<0.01,r=-0.386 3)。结论 Atg5与PTEN的异常表达可能与PCa的发生密切相关,二者在肿瘤的恶性进程中扮演重要角色。