中、意蜂Atg12基因克隆表达及生物信息学分析

试验旨在探究自噬相关基因Atg12(autophagy-related 12 gene)在中华蜜蜂(中蜂)、意大利蜜蜂(意蜂)中的表达差异,为探讨中蜂抗螨分子机理提供参考。参照GenBank中东方蜜蜂Atg12基因序列(登录号:XM_017048509.1)设计引物,扩增中、意蜂头部组织Atg12基因,并对其进行克隆、测序、原核表达及其氨基酸序列和蛋白结构分析,同时采用实时荧光定量PCR技术分析该基因在中、意蜂头部组织中的表达差异。结果显示,本试验成功扩增出大小为450 bp的目的片段,并表达出大小约42 ku重组蛋白;遗传进化树分析表明,在Atg12基因进化过程中,中蜂(Apis cerana cerana)、意蜂(Apis mellifera)、大蜜蜂(Apis dorsata)和小蜜蜂(Apis florea)亲缘关系较近;重组蛋白生物信息学分析显示,该蛋白的二级结构中共含有6个多肽结合位点、6个β-折叠和4个α-螺旋,分子质量约为16.13 ku,等电点为6.73;实时荧光定量PCR结果显示,Atg12基因在中蜂头部组织中表达极显著高于意蜂(P<0.01)。本试验结果为后续深入研究Atg12基因在中蜂抗螨上的作用机制提供了参考。

miR-23b通过调控ATG12抑制宫颈癌细胞自噬并逆转顺铂耐药性

目的探讨microRNA-23b(miR-23b)通过调控自噬相关基因-12(ATG12)的表达抑制宫颈癌细胞自噬并逆转顺铂耐药性的作用机制。方法采用顺铂长期浓度梯度递增法体外建立HeLa/DDP耐药细胞株,分别转染阴性空质粒(miR-NC组)和miR-23b mimics(miR-23b mimics组),另将未经处理的HeLa/DDP细胞作为空白对照组,将自噬诱导剂雷帕霉素干预细胞作为miR-23b mimics+雷帕霉素组。采用实时荧光定量PCR(qPCR)法和Western blotting法检测miR-23b和ATG12表达。双荧光素酶报告实验分析miR-23b的靶基因。采用MTT法和Annexin V/PI双染法检测各组细胞对顺铂的敏感性。另外采用电镜和共聚焦显微镜观察各组细胞自噬体的形成情况。结果历时6个月,成功建立HeLa/DDP细胞,其耐药指数为14.613±0.319。与HeLa细胞比较,HeLa/DDP细胞中miR-23b表达量下降(1.02±0.13 vs.0.45±0.08),而ATG12蛋白表达量升高(0.31±0.03 vs.0.90±0.08),差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,ATG12是miR-23b下游靶基因。与空白对照组和miR-NC组比较,miR-23b mimics组HeLa/DDP细胞中GFP-LC3绿色荧光的细胞质小点明显减少,且ATG12蛋白表达量降低(P<0.05);但是miR-23b mimics+雷帕霉素组细胞中出现大量GFP-LC3荧光小泡。经流式细胞术检测,miR-23b mimics组HeLa/DDP细胞凋亡率明显高于空白对照组和miR-NC组,而miR-23b mimics+雷帕霉素组细胞凋亡率则低于miR-23b mimics组(P<0.05)。结论miR-23b与宫颈癌细胞对顺铂获得性耐药有关,而ATG12是miR-23b抑制耐药细胞自噬的下游蛋白。