miR-30b inhibits autophagy to alleviate hepatic ischemiareperfusion injury via decreasing the Atg12-Atg5 conjugate

AIM: To explore the role and potential mechanism of miR-30 b regulation of autophagy in hepatic ischemiareperfusion injury(IRI).METHODS: An animal model of hepatic IRI was generated in C57BL/6 mice. For in vitro studies, AML12 cells were immersed in mineral oil for 1 h and then cultured in complete Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)/F12 to simulate IRI. Mice and cells were transfected with miR-30 b agomir/mimics or antagomir/inhibitor to examine the effect of miR-30 b on autophagy to promote hepatic IRI. The expression of miR-30 b was measured by real-time polymerase chain reaction. Apoptotic cells were detected by terminal uridine nickend labeling(TUNEL) staining, and cell viability was detected by methylthiazole tetrazolium assay. The expression of light chain 3, autophagy-related gene(Atg)12, Atg5, P62, and caspase-3 were detected by western blotting analysis.RESULTS: miR-30 b levels were significantly downregulated after hepatic IRI, and the numbers of autophagosomes were increased in response to IRI both in vivo and in vitro. These findings demonstrate that low levels of miR-30 b could promote hepatic IRI. Furthermore, we found that miR-30 b interacted with Atg12-Atg5 conjugate by binding to Atg12. Overexpression of miR-30 b diminished Atg12 and Atg12-Atg5 conjugate levels, which promoted autophagy in response to IR. In contrast, downregulation of miR-30 b was associated with increased Atg12-Atg5 conjugate levels and increased autophagy.CONCLUSION: miR-30 b inhibited autophagy to alleviate hepatic ischemia-reperfusion injury via decreasing the Atg12-Atg5 conjugate.

rno-miR-30b-5p调控Atg5、Atg12和Becn1自噬基因表达在实验性自身免疫性葡萄膜炎中的作用

目的探讨rno-miR-30b-5p对Atg5、Atg12和Becn1自噬基因表达的调控作用及其在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)中的表达变化。方法 双荧光素酶检测mo-miR-30b-5p对Atg5、Atg12和Becn1自噬基因表达的调控作用。Lewis大鼠随机分为正常对照组和EAU组,每组各6只,EAU组诱导EAU模型,两组大鼠每天用Genesis-A眼底相机观察眼底情况。免疫后12 d,取眼球观察睫状体、视网膜的病理学表现;分离大鼠的脾脏和淋巴结,实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测rno-miR-30b-5p、Atg5、Atg12和Becn1 mRNA的表达情况;ELISA方法检测Atg5、Atg12和Becn1蛋白的表达水平。结果双荧光素酶检测结果证实Atg5、Atg12和Becn1为rno-miR-30b-5p调控的靶基因。免疫后12 d,EAU组大鼠眼底血管严重肿胀,病理学检测可见睫状体、视网膜内大量炎性细胞浸润。Q-PCR检测结果示,与正常对照组相比,免疫后12 d EAU组大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p mRNA水平分别为0.46±0.01和0.29±0.17,均呈下调表达(均为P<0.01);Atg5、Atg12和Becn1 mRNA水平均呈上调表达,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ELISA检测结果示,EAU组大鼠脾脏和淋巴结中Atg5、Atg12和Becn1蛋白表达水平均明显高于正常对照组大鼠(均为P<0.05)。结论 rno-miR-30b-5p可调控Atg5、Atg12和Becn1的表达。在EAU大鼠脾脏和淋巴结中,rno-miR-30b-5p的下调表达使Atg5、Atg12和Becn1基因和蛋白的表达水平均明显升高,从而影响葡萄膜炎的发展进程。

牦牛Atg5基因克隆及其在输卵管、卵巢和子宫中的表达定位

自噬是一种保守的细胞内降解过程,在多种生物体内证实自噬有重要的生物学意义。但是自噬在牦牛这一高原特色物种体内的研究未见报道。因此为探索正常生理条件下自噬相关基因在牦牛生殖过程中的表达,本研究分别采集牦牛不同繁殖周期(卵泡期、黄体期及妊娠期)的主要生殖器官(输卵管、卵巢、子宫),克隆牦牛自噬相关基因5(Autophagy related 5,Atg5)基因并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR检测Atg5 基因在组织中的相对表达量;并采用蛋白质免疫印迹(Western-blot, WB)检测Atg5和Atg5-Atg12(Autophagy related 12,自噬相关基因12)复合体在不同组织中的表达水平;免疫组织化学方法分析Atg5在各生殖器官中的分布特征。结果显示,成功克隆牦牛Atg5基因在进化过程中高度保守,编码的蛋白质为可溶性的非跨膜蛋白;qRT-PCR和WB检测结果显示Atg5和Atg5-Atg12复合体在牦牛输卵管、卵巢和子宫中均有表达。其中卵泡期卵巢Atg5-Atg12表达显著高于黄体期和妊娠期,卵泡期Atg5的表达却显著低于黄体期和妊娠期;黄体期输卵管Atg5-Atg12表达量显著高于卵泡期和妊娠期,妊娠期输卵管中Atg5的表达量显著高于卵泡期和黄体期;卵泡期和妊娠期子宫中Atg5-Atg12的表达量显著高于黄体期,而黄体期子宫中的Atg5的表达量又显著高于妊娠期和卵泡期,在蛋白水平上Atg5和Atg5-Atg12的表达呈负相关。免疫组织化学结果显示Atg5在输卵管黏膜上皮,卵巢卵泡膜、颗粒层、生殖上皮、黄体细胞,子宫内膜和子宫腺体均有表达。研究结果表明自噬在牦牛体内与其他物种相似具有保守性,通过检测Atg5-Atg12复合体在牦牛生殖器官中的表达,推测自噬可能参与牦牛生殖生理过程的调控。该研究结果对自噬在其他大型哺乳动物以及高寒低氧环境中动物的研究具有借鉴意义,有助于自噬参与其他动物生殖生理作用机制的研究。

猪繁殖与呼吸综合征病毒对Marc145细胞自噬相关基因转录的影响及分析

自噬参与多种疾病过程,且与病毒感染与增殖关系密切。为探究Marc145细胞感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)后自噬相关基因Beclin1、ATG5和ATG12mRNA转录差异及规律、PRRSV增殖与细胞自噬的联系;采用实时荧光定量PCR方法对自噬相关基因Beclin1、ATG5和ATG12 mRNA的转录进行测定,绘制了转录规律曲线图;并经实时荧光定量测定并绘制PRRSV在Marc145细胞中增殖规律图。结果显示,试验组自噬相关基因转录量明显高于对照组,表明PRRSV能诱导Marc145细胞自噬,且使Beclin1、ATG5和ATG12mRNA提前进入高转录状态;其转录规律与细胞病变、PRRSV增殖规律呈正相关。

β-arrestins负调控自噬促进糖尿病肾病足细胞损伤

目的β-arrestins是-类负反馈调节G蛋白偶联受体（GPCRS）的多功能蛋白,β-arrestins同时也可以激活非G蛋白依赖的信号通路.本课题拟对β-arrestins在糖尿病肾病中的作用及机制进行研究.方法选取10周龄β-arrestin-1-/-、β-arrestin-2-/-和野生C57BL/6小鼠单肾摘除后,采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病肾病（DN）小鼠模型,成模后12wk处死小鼠,检测体内自噬相关蛋白的变化.体外采用高糖刺激足细胞以及GFP-RFP-LC3腺病毒转染监测不同阶段自噬的变化.结果在STZ诱导糖尿病肾病小鼠、ob/ob小鼠以及糖尿病肾病病人肾活检中β-arrestin-1和β-arrestin-2均表达明显升高,β-arrestin-1或β-arrestin-2敲除可明显减轻DN小鼠肾损伤.体外高糖刺激足细胞β-arrestin-1和β-arrestin-2升高,且β-ar-restin-1和β-arrestin-2都是通过抑制ATG12-ATG5的结合以及活化Wnt/β-catenin信号通路来抑制足细胞的自噬.结论β-arrestin-1和β-arrestin-2可以抑制足细胞的自噬,提示β-arrestins在多因素诱导糖尿病肾病自噬降低导致的肾损伤中有重要作用.此通路可以作为糖尿病肾病临床治疗的潜在靶点.

新风胶囊治疗大鼠骨关节炎

目的主要观察新风胶囊(黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣)对骨关节炎大鼠外周血免疫球蛋白IgG1、IgG2α及细胞因子IL-4、TNF-α,软骨、胸腺、脾脏自噬基因(Atg5、Atg7、Atg12)的表达的影响。方法大鼠随机设正常对照组和模型对照组(均予生理盐水)、氨基葡萄糖对照组,以及新风胶囊组,每组10只。除正常对照组外,采用关节腔注射木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸方法制成骨关节炎大鼠模型,造模后第14天给药30 d。以光镜对大鼠软骨进行Mankin标准评分;采用ELISA法检测血清细胞因子IgG1、IgG2α、IL-4,和TNF-α;采用RT-PCR对骨关节炎大鼠软骨、胸腺、脾脏中的自噬相关基因Atg5、Atg7和Atg12进行检测。结果给药后,与正常组比较,模型组体质量明显下降,Mankin评分明显升高,血清IgG1、IgG2α、TNF-α升高,IL-4降低,在胸腺、脾脏、软骨等各组织中,Atg存在不同程度的降低(P<0.05或P<0.01);与氨基葡萄糖组比较,新风胶囊组体质量明显升高,Mankin评分明显降低,IL-4及Atg5、Atg7、Atg12升高(P<0.01或P<0.05)。结论新风胶囊可以抑制炎症反应,调节大鼠整体自噬水平,达到治疗骨关节炎。

中医药调控细胞自噬防治消化系统疾病研究现状

消化系统疾病是临床中常见病、多发病,临床表现纷繁复杂,疾病之间相互关联,严重影响患者生命质量。细胞自噬是维护胃黏膜细胞稳态的重要因素,是导致消化系统疾病发病的重要环节。中医药作为临床防治消化系统疾病的重要干预措施之一,其防治作用及机制成为近年来研究的重要方向。本文通过收集相关文献资料,重点从ULK1蛋白激酶复合体、Vps34-Beclin1和Ⅲ型PI3K复合体、mAtg9、Atg5-Atg12-Atg16连接系统和LC3连接系统中具体信号通路及相关蛋白分析近年来中医药对消化系统疾病细胞自噬的调控的研究现状,以期发现中医药调节自噬对于细胞保护的作用,从而对于中医药防治消化系统疾病提供依据。

苯乙基异硫氰酸酯对良性前列腺上皮细胞增殖凋亡的影响及相关机制研究

目的探讨苯乙基异硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)对人类良性前列腺上皮细胞(benign prostatic hyperplasia cell line,BPH-1)增殖与凋亡的影响及其相关机制。方法体外培养人永生化前列腺上皮细胞,给予6、12、24μmol/L PEITC或等量溶剂二甲基亚砜,分别作用6、12、24 h。采用CCK-8检测前列腺上皮细胞活性;Annexin V及PI标记,流式细胞技术检测PEITC处理24 h后BPH-1细胞凋亡及坏死比例;Western blotting测定PEITC处理24 h后BPH-1细胞中X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)及自噬相关蛋白5-12(Atg5-12)表达变化;RT-PCR检测PEITC处理24 h后BPH-1细胞中XIAP mRNA表达情况。结果(1)BPH-1细胞经过6、12、24μmol/L PEITC处理6 h后,细胞相对活性分别为71.22%、48.90%、13.57%;处理12 h后分别为52.57%、42.37%、10.11%;处理24 h后分别为36.73%、25.88%、8.39%;处理36 h后分别为33.57%、25.83%、13.06%,呈现浓度依赖性和时间依赖性。(2)BPH-1细胞在6、12、24μmol/L PEITC处理24 h后,细胞凋亡率分别为19.5%、30.4%、40.1%;与对照组相比,12、24μmol/L处理组差异均具有统计学意义(P<0.05)。(3)BPH-1细胞在6、12、24μmol/L PEITC处理24 h后,XIAP蛋白表达量及mRNA表达量均下调,Atg5-12蛋白表达量下调,并呈现剂量依赖性。结论PEITC可抑制前列腺上皮细胞增殖,通过下调BPH-1中XIAP mRNA而降低XIAP蛋白表达,促进前列腺上皮细胞的凋亡并呈现出剂量依赖性;同时PEITC下调了自噬相关蛋白Atg5-12;PEITC对凋亡与自噬的调节可能存在相关性。

Progranulin regulation of autophagy contributes to its chondroprotective effect in osteoarthritis

Progranulin(PGRN)is a multifunctional growth factor involved in many physiolog-ical processes and disease states.The apparent protective role of PGRN and the importance of chondrocyte autophagic function in the progression of osteoarthritis(OA)led us to investi-gate the role of PGRN in the regulation of chondrocyte autophagy.PGRN knockout chondro-cytes exhibited a deficient autophagic response with limited induction following rapamycin,serum starvation,and IL-1b-induced autophagy.PGRN-mediated anabolism and suppression of IL-1b-induced catabolism were largely abrogated in the presence of the BafA1 autophagy inhibitor.Mechanistically,during the process of OA,PGRN and the ATG5eATG12 conjugate form a protein complex;PGRN regulates autophagy in chondrocytes and OA through,at least partially,the interactions between PGRN and the ATG5eATG12 conjugate.Furthermore,the ATG5eATG12 conjugate is critical for cell proliferation and apoptosis.Knockdown or knockout of ATG5 reduces the expression of ATG5eATG12 conjugate and inhibits the chondroprotective effect of PGRN on anabolism and catabolism.Overexpression of PGRN partially reversed this effect.In brief,the PGRN-mediated regulation of chondrocyte autophagy plays a key role in the chondroprotective role of PGRN in OA.Such studies provide new insights into the pathogen-esis of OA and PGRN-associated autophagy in chondrocyte homeostasis.