自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的生长和致病

【背景】假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)引起的小麦茎基腐病是我国小麦生产上的新病害。自噬是真核生物中普遍发生的细胞过程,调控多种植物病原真菌的生长发育和侵染,但其在假禾谷镰孢中的作用还不明确。【目的】明确假禾谷镰孢自噬相关基因FpAtg3在该病菌生长和致病中的作用,解析假禾谷镰孢致病机理,为小麦茎基腐病科学防控提供理论依据。【方法】从NCBI数据库中下载主要真菌的Atg3氨基酸序列,利用MEGA5.05构建系统进化树。利用Split-PCR策略构建FpAtg3基因敲除盒,经PEG介导的原生质体转化导入假禾谷镰孢野生型菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性转化子,并经PCR检测获得FpAtg3基因缺失突变体(ΔFpAtg3)。构建pKNTG-FpAtg3重组载体,导入ΔFpAtg3菌株,利用FpAtg3自身启动子启动FpAtg3的转录,以获得FpAtg3缺失突变体的回补菌株。利用假禾谷镰孢营养生长的培养基PDA、CM和MM测定菌丝生长速率和菌落形态;PDA培养基上测定菌丝形态和菌丝融合率;CMC培养液中测定分生孢子的产量及形态;皮氏培养基上测定孢子融合芽管调控的融合率。将假禾谷镰孢的菌丝块接种小麦胚芽鞘和大麦叶片测定病原菌的致病力,采用盆栽试验测定假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病。在PDA培养基中分别加入刚果红、SDS和过氧化氢测定假禾谷镰孢对细胞壁、细胞膜和氧化胁迫的耐受性。【结果】细胞自噬相关蛋白Atg3在真菌中非常保守,且与生物进化的方向一致,假禾谷镰孢FpAtg3与禾谷镰孢和尖镰孢的Atg3同源性最高。获得了FpAtg3基因缺失突变体和回补菌株,表型测定结果显示,与假禾谷镰孢野生型和回补菌株相比,ΔFpAtg3在营养培养基上的菌丝生长明显减慢,气生菌丝减少,菌丝呈波纹状卷曲,分生孢子产量减少,孢子变短,分生孢子分隔减少;野生型和回补菌株菌丝融合发生非常普遍,在相同条件下ΔFpAtg3的菌丝融合率和孢子融合芽管调控的融合率均明显降低;ΔFpAtg3侵染大麦叶片和小麦胚芽鞘造成的病斑较野生型和回补菌株侵染的病斑明显减小,盆栽试验进一步验证ΔFpAtg3的致病力降低;与野生型和回补菌株相比,ΔFpAtg3在刚果红、SDS和过氧化氢胁迫中的耐受性降低。【结论】自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生、菌丝融合、致病力以及对非生物胁迫的耐受性.

ATG3 rs2638029、rs3732817基因多态性与广西地区抗中性粒细胞胞质抗体相关性小血管炎的相关性

目的探讨广西地区人群自噬相关基因(ATG)3 rs2638029、rs3732817位点多态性与原发抗中性粒细胞胞质抗体相关性小血管炎(AAV)的关联关系。方法采用多重PCR结合高通量测序技术检测194例AAV患者(AAV组)和195例健康成人(对照组)ATG3 rs2638029、ATG3 rs3732817位点的基因型,并收集受试者相关临床资料,分析其基因多态性与AAV易感性、临床症状的关系。结果ATG3 rs2638029、ATG3 rs3732817等位基因和基因型在AAV组和对照组分布差异无统计学意义(P>0.05),两位点存在连锁不平衡(D′=0.969,r^(2)=0.249),两位点可构建3个常见单体型,在AAV组和对照组中,各单体型分布差异无统计学意义(P>0.05)。ATG3 rs2638029及rs3732817不同基因型之间,水肿、血尿、蛋白尿症状发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。ATG3 rs2638029位点不同基因型IgG水平分布差异有统计学意义(P<0.05)。ATG3 rs3732817位点不同基因型白蛋白水平分布差异有统计学意义(P<0.05)。结论广西人群中的AAV患者ATG3基因多态性可能与IgG水平升高、低白蛋白血症相关联,但可能与AAV患者的遗传易感性无明显关联性。

Atg3及自噬对非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响

目的探讨自噬相关基因Atg3和自噬对非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响及相关机制。方法饥饿处理诱导非小细胞肺癌A549细胞自噬,Transwell法检测细胞迁移能力的变化,Western blot检测自噬相关基因Atg3的表达。转染Atg3 si RNA靶向沉默Atg3的表达,Transwell法检测细胞迁移能力的变化、流式细胞术检测细胞凋亡、Western blot检测细胞的自噬活性以及E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、Notch和snail的表达。结果饥饿处理可诱导非小细胞肺癌A549细胞自噬活性增强,并提高Atg3的表达,促进细胞迁移,而不影响细胞凋亡。沉默Atg3可抑制饥饿诱导的细胞自噬及迁移,而不影响细胞凋亡。此外沉默Atg3之后,E-cadherin和β-catenin的表达明显升高,而N-cadherin、vimentin、Notch和snail的表达明显降低。结论沉默Atg3可减弱自噬活性,抑制A549细胞的迁移;其机制可能与Notch/snail信号通路活性降低进而影响细胞的EMT进程有关。

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)ATG3基因克隆及其在WSSV感染中的表达

为了揭示凡纳滨对虾自噬相关基因LvATG3在对虾先天免疫过程中的作用,利用PCR技术克隆出LvATG3,利用荧光定量PCR方法检测LvATG3在凡纳滨对虾不同组织中的表达,用白斑综合症病毒(WSSV)侵染凡纳滨对虾,检测WSSV侵染后不同时间LvATG3的基因表达情况.LvATG3 ORF区全长948 bp,编码315个氨基酸,蛋白相对分子质量为35.527×10^(3),对应等电点为4.58.LvATG3基因在凡纳滨对虾的眼柄、鳃、心脏、神经、血细胞等11种组织中均有表达,在中肠、后肠、鳃和血细胞中表达量较高.血细胞中,LvATG3的表达在WSSV病毒感染的不同时间呈现先下降再上升的趋势.凡纳滨对虾LvATG3参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用.

自噬相关基因Atg3、Ambra1与慢性单纯性鼻窦炎、鼻息肉及鼻息肉伴发哮喘的相关性研究

目的自噬是机体的一种重要的保护和防御机制。研究拟通过对自噬相关基因Atg3、Ambra1表达的观察,探讨自噬与慢性鼻窦炎（CRS）及哮喘之间的关联性及可能的作用机制。方法收集24例鼻中隔偏曲患者的下鼻甲黏膜作为正常对照组,选取21例慢性单纯性鼻窦炎患者（CRSs NP组）、22例慢性鼻窦炎鼻息肉患者（CRSw NP组）及18例慢性鼻窦炎鼻息肉伴发哮喘患者（CRSw NP伴哮喘组）的鼻腔黏膜组织为实验组。采用免疫组织化学染色技术检测Atg3、Ambra1在各组中的表达强度及分布,分析自噬相关基因在各组间表达的差异,并分析各组中两基因之间的相关性。结果 1自噬相关基因Atg3在对照组、CRSs NP组、CRSw NP组、CRSw NP伴哮喘组中表达逐渐增强,在各组间表达差异有统计学意义（χ^2=31.080,P〈0.001）;进一步两两比较,在对照组与CRSs NP组之间（P=0.002）、对照组与CRSw NP组之间（P〈0.001）、对照组与CRSw NP伴哮喘组之间（P〈0.001）、CRSs NP组与CRSw NP伴哮喘组之间（P=0.002）、CRSw NP组与CRSw NP伴哮喘组之间（P=0.024）表达差异均有统计学意义,在CRSs NP组与CRSw NP组之间（P=0.304）表达差异无统计学意义。2自噬相关基因Ambra1在对照组、CRSs NP组、CRSw NP组、CRSw NP伴哮喘组中表达逐渐增强,在各组间表达差异有统计学意义（χ^2=33.000,P〈0.001）;进一步两两比较,在对照组与CRSs NP组之间（P=0.009）、对照组与CRSw NP组之间（P〈0.001）、对照组与CRSw NP伴哮喘组之间（P〈0.001）、CRSs NP组与CRSw NP伴哮喘组之间（P〈0.001）、CRSw NP组与CRSw NP伴哮喘组之间（P=0.009）表达差异均有统计学意义,在CRSs NP组与CRSw NP组之间（P=0.205）表达差异无统计学意义。3⒏Atg3与Ambra1在CRSs NP组（r=0.619,P=0.003）、CRSw NP组（r=0.392,P=0.022）和CRSw NP伴哮喘组（r=0.552,P=0.033）中表达呈正相关性,在对照组中无相关性（r=0.316,P=0.133）。结论细胞自噬与CRS疾病的发生发展密切相关,可能参与了CRSw NP伴哮喘的发生,且自噬相关基因Atg3与Ambra1在CRS的发生发展过程中可能存在协同作用,自噬可成为CRS诊疗新的研究方向。

自噬基因Atg3和Atg5在儿童急性白血病骨髓单个核细胞中的表达及临床意义

目的 通过检测儿童急性白血病（AL）骨髓单个核细胞（BMMNCs）中的自噬相关基因Atg3和Atg5的表达,探讨细胞自噬在儿童AL发病机制中的意义.方法 选取郑州大学第一附属医院儿科血液病区确诊AL患儿骨髓标本74例,分为初治组37例,缓解组28例,难治复发组9例;对照组选取非肿瘤性疾病患儿骨髓标本28例.淋巴细胞分离液分离出BMMNC,采用单丹磺酰尸胺（MDC）染色后荧光显微镜、流式细胞仪检测细胞自噬,反转录（RT）-PCR检测自噬基因Atg3 mRNA和Atg5 mRNA的表达.结果 荧光显微镜下观察到初治组、难治复发组细胞自噬现象较多见,经流式细胞术检测,初治组、难治复发组的自噬率分别为（17.07±2.31）％、（15.37±1.59）％,明显高于对照组的（2.71±1.57）％,差异均有统计学意义（t=28.29、20.96,P均＜0.01）;缓解组自噬率为（3.48±1.94）％,与对照组相比差异无统计学意义（t=1.634,P＞0.05）;难治复发组高于缓解组（t =16.61,P＜0.05）.Atg3 mRNA和Atg5 mRNA在初治组和难治复发组的表达均高于对照组,难治复发组亦均高于缓解组,差异均有统计学意义（F=67.592、106.160,P均＜0.008）;缓解组与对照组间比较差异无统计学意义（P ＞0.008）.结论 初治组和难治复发组BMMNC的自噬活性增强,自噬相关基因Atg3 mRNA、Atg5 mRNA的表达均上调,揭示Atg3、Atg5基因激活诱导的自噬活性增强可能与儿童AL的发生、发展和耐药机制有关.

不同剂量中波紫外线对HaCaT细胞p62及自噬体形成关键基因Beclin-1、Atg12和Atg3的调控效应研究

目的探讨不同剂量中波紫外线（UVB）照射培养的HaCaT细胞后不同时间点对p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白表达水平的调控效应。方法使用4．5、10和50mJ／cm2 UVB照射HaCaT细胞，照射后加入新鲜培养基继续培养4h和12h，同时设相同处理但不照射UVB的细胞为对照细胞。另设观察组，在照射后立即（包括对照细胞），使用含蛋白酶抑制剂E64D（10ug／L）和胃酶抑素（10ug／L）的培养基孵育4h和12h，以阻断对p62的降解。使用Western印迹法测定Hac胛细胞p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白的表达水平。结果50mJ／cm2 UVB照射HaCaT细胞后4h，p62表达水平（p62与内参的比值为0．473±0．022）较对照细胞（0．246±0．038）升高（t=15．27，P〈0．05）；阻断溶酶体后，细胞新生p62的水平（0．445±0．035）与阻断溶酶体的对照（0．244±0．016）相比，仍为上调（t=7．62，P〈0．05）。在4．5mJ／cm2 UVB照射细胞后12h，与对照（0．254±0．035）相比，HacaT细胞p62表达上调（0．497±0．047，t=22．89，P〈0．05）；阻断溶酶体后，与阻断溶酶体的对照（0．257±0．025）相比，p62表达水平仍然上调（0．548±0．051，t=17．42，P〈0．05）。4．5mJ／cm2和50mJ／cm2 UVB照射后4h和12h，对照细胞和照射细胞间的Beelin-1、Atg12和Atg3的表达差异均无统计学意义（P〉0．05），阻止溶酶体对白噬体内容物的降解也未能发现Beclin-1、Atg12和Atg3的表达差异（P〉0．05）。结论p62表达在不同剂量UVB照射和照射后不同时间存在差异调控，并且这种调控效应与自噬体形成可能没有生物学联系。

ATG3基因多态性与中国西部结核病患者的易感性及症状相关性研究

目的调查自噬相关基因3(autophagy-related gene 3,ATG3)基因多态性与中国西部结核病患者结核病发生发展及临床症状的关系。方法根据纳入排除标准,最终纳入2014年12月—2015年11月于四川大学华西医院就诊的476例结核病患者(结核病组)和475例健康对照者(健康对照组),采用高通量基因分型技术对ATG3的3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)(rs2638029、rs2638037、rs3732817)进行基因型检测,并收集受试者相关临床资料,应用χ2检验、logistic回归模型等统计学方法分析其基因多态性与结核病易感性、临床症状的关系。结果经性别、年龄校正后,rs2638029和rs3732817的等位基因频率、基因型、遗传模型在两组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);除GA基因型[比值比(odds ratio,OR)=1.375,95%置信区间(confidence interval,CI)(1.048,1.805),P=0.022]和显性遗传模型GG+GA[OR=1.326,95%CI(1.024,1.717),P=0.032]外,rs2638037的等位基因频率、基因型及遗传模型在两组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。经Bonferroni校正后,GA基因型及显性遗传模型GG+GA在两组间比较亦无统计学意义(P=0.132、0.201)。单倍型CGA与结核易感性相关[OR=1.262,95%CI(1.001,1.593),P=0.048]。体重减轻症状在rs2638037各基因型之间差异有统计学意义(χ2=8.131,P=0.017)。结论 ATG3基因的3个SNP形成的单倍型CGA可能与结核病的发生发展有关,rs2638037 SNP可能与体重减轻有关,未来仍需深入研究。

自噬相关基因Atg3在埃博拉病毒组装过程中的作用研究

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研究首先根据CRISPR/Cas9技术构建了携带有Atg3基因靶向向导RNA(guide RNA,gRNA)、表达Cas9的重组质粒pSpCas-Atg3,将此质粒转染至人胚胎肾细胞293T中,之后采用流式分选结合有限稀释法筛选单细胞克隆。细胞基因测序及Western Blot试验表明成功获得了Atg3基因敲除的细胞系。在Agt3基因敲除细胞系和野生型细胞中分别共同转染表达EBOV囊膜蛋白(Glycoprotein,GP)和基质蛋白的重组质粒,包装病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP);同时在两种细胞中组装整合有EBOV的重组HIV假病毒,获得的假病毒感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),通过测定报告基因的活性判定病毒对细胞的侵入能力。结果显示Atg3基因缺失后,VLP所整合的GP蛋白显著增多,假病毒对细胞的侵染能力也明显增强(P<0.001),表明Agt3能够负调控EBOV的组装和入侵。本研究为开发新抗病毒药物提供了新思路。

芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠肝脏细胞自噬的影响

目的观察芪术颗粒对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型自噬的影响。方法将40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、复方鳖甲软肝片组、芪术颗粒组,除正常对照组外其余各组均腹腔注射CCl4建立肝纤维化模型,按照组别对应处理。4周后取肝组织,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及自噬相关基因3(autophagy-related gene 3,Atg3)、自噬相关基因Beclin1介导的蛋白表达,Real-time PCR检测Atg3、Beclin1基因表达,电镜下观察自噬情况。结果与正常对照组比较,模型对照组大鼠肝α-SMA蛋白显著增多(P<0.01);与模型对照组比较,复方鳖甲软肝片组、芪术颗粒组肝α-SMA蛋白显著减少(P<0.05);与正常对照组比较,模型对照组大鼠肝Atg3蛋白表达显著增加(P<0.01),Atg3基因表达增加,Beclin1蛋白及基因表达增加,自噬溶酶体和自噬体数量增多;与模型对照组比较,芪术颗粒组、复方鳖甲软肝片组Atg3蛋白及基因表达降低(P<0.05),芪术颗粒组Beclin1蛋白及基因表达降低(P<0.05),芪术颗粒组、复方鳖甲软肝片组组织中自噬溶酶体、自噬体数量减少。结论芪术颗粒可通过抑制肝脏细胞Atg3、Beclin1表达而影响自噬从而发挥其抗肝纤维化作用。

自噬相关基因在乳腺癌ET方案新辅助化疗疗效预测中的作用

目的明确自噬相关基因在乳腺癌ET方案(表柔比星+多西紫杉醇)新辅助化疗疗效预测中的作用。方法回顾性收集41例接受ET方案新辅助化疗患者化疗前的乳腺癌病理组织标本,分别以蛋白质印迹法(Western blot)、实时荧光定量PCR及免疫组织化学检测各组织中自噬相关基因Atg3和Beclin1的表达情况,并通过统计学Fisher确切概率法,分析化疗前Atg3和Beclin1表达与化疗后疗效的关系。结果经Western blot、实时荧光定量PCR及免疫组织化学检测发现41例化疗前乳腺癌组织标本中有24例Atg3与Beclin1高表达,其中化疗后有效者(完全缓解或部分缓解)23例(95.8%),无效者(疾病进展)1例;另17例乳腺癌组织Atg3与Beclin1化疗前无表达或低表达,其中化疗后有效者(完全缓解或部分缓解)3例(17.6%),无效者(疾病稳定或疾病进展)14例。化疗前Atg3与Beclin1高表达的患者化疗有效率明显高于无表达或低表达患者(P<0.05)。结论Atg3与Beclin1高表达可作为预测乳腺癌ET方案新辅助化疗疗效的指标之一。

人自噬相关基因3原核表达及蛋白纯化和鉴定

自噬相关基因3（autophagy related gene 3,ATG3）及其对应的蛋白是一种泛素样缀合酶。研究发现,细胞自噬体的形成,离不开2个必需系统的参与：1个是对于ATG12与ATG5两种自噬蛋白结合形成微管相关蛋白-轻链3（microtubule-associated protein light chain 3,LC3）前体的调节系统,此阶段需要El样酶ATG7和E2样酶ATG10共同参与活化,1个是对于自噬体LC3蛋白的脂化系统[1],它们都属于泛素样蛋白结合系统，而ATG3作为泛素样缀合酶，在LC3蛋白的脂化系统中起到重要作用。

Ctk1蛋白在自噬过程中的作用

细胞自噬是一种在真核生物中十分保守的溶酶体依赖性胞内降解途径,通过形成双层膜结构包裹细胞质内的生物大分子或者细胞器运送到溶酶体进行降解。在实验中发现,Ctk1蛋白对自噬过程有重要调节作用。Ctk1的缺失或者失活都会导致自噬过程不能正常发生,同时也会影响酵母CVT途径。自噬相关蛋白Atg3与Atg8的结合受到Ctk1的调控影响。因此,Ctk1在自噬过程中自噬体的形成中发挥了重要作用,揭示了Ctk1的新的功能作用。

自噬及凋亡因子在慢性氟中毒大鼠肝脏中表达

目的探讨自噬相关因子LC3A、Beclin-1及凋亡因子Bcl-2、Bax在慢性氟中毒大鼠肝脏中的表达意义。方法将36只健康SD大鼠按体重随机分为对照组、低氟组、高氟组,分别用含氟量<1 mg/L的自来水和含氟5、50 mg/L的含氟水饲养6个月,观察氟斑牙形成情况;测定尿氟、骨氟含量以及大鼠肝功能;苏木素-伊红染色观察肝脏病理形态学改变;免疫组织化学法检测大鼠肝组织中微管相关蛋白轻链3A(LC3A)、哺乳动物ATG6同源蛋白(Beclin-1)及B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白细胞基因伴随蛋白x(Bax)的蛋白表达水平。结果与对照组比较,低、高氟组大鼠尿氟含量分别为[(2.18±0.14)、(2.40±0.19)mg/L]、骨氟含量分别为[(237.42±18.48)、(248.00±14.72)mg/kg]均明显升高(P<0.05);染氟组大鼠肝脏肝细胞索排列紊乱,肝细胞肿大,部分肝细胞胞质透亮,呈空泡样改变;与对照组比较,染氟组大鼠血清中谷丙转氨酶活性及谷草转氨酶活性明显升高(P<0.05);低、高氟组大鼠肝脏LC3A[(35.35±2.71)、(44.10±6.72)]、Beclin-1[(57.56±12.1)、(74.76±18.67)]及Bax[(51.1±9.23)、(62.32±10.3)]蛋白表达明显高于对照组,Bcl-2蛋白表达分别为[(55.18±8.36)、(39.05±6.91)]明显低于对照组(P<0.05)。结论过量氟可激活大鼠肝组织中自噬和凋亡因子,自噬和凋亡可能共同参与慢性氟中毒所致肝脏损伤的发病过程。

Noncanonical ATG8—ABS3 interaction controls senescence in plants

With the support by the National Natural Science Foundation of China?the research team led by Prof.Yu Fei(郁飞)at the State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas and College of Life Sciences.Northwest A&-F University,uncovered a new senescence regulatory pathway controlled by ATG8 ABS3-mediated proteostasis.