人巨细胞病毒IE及L基因片段的检出与动脉粥样硬化的关系

以自行设计及合成的两对引物，利用聚合酶链反应，检测了５５份不同类型动脉粥样硬化血管组织中人巨细胞病毒（Ｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＨＣＭＶ）的ＩＥ及Ｌ基因片段，阳性率高达５９．９％（３３／５５），而作为对照的正常冠状动脉及大隐静脉却仅为４５％（１／２２），表明ＨＣＭＶ感染与动脉粥样硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ａｓ）的发生密切相关。比较同一组织标本中ＨＣＭＶＩＥ及Ｌ基因的检测结果发现，除个别Ａｓ组织同时可检出ＩＥ及Ｌ基因外，８１．８％的Ａｓ组织ＤＮＡ仅表现为ＩＥ或Ｌ基因阳性，提示ＨＣＭＶ基因组中不同的基因片段在Ａｓ发生发展中可能起着不同的生物学作用。

HCMV的IE2介导野生型p53基因促凋亡作用的研究

选择野生型P5 3缺失型的Jurkat细胞系 ,首先将wt p5 3 pLXSN稳定转染入Jurkat细胞 (Jurkat wt p5 3) ,再分别或联合转染IE1、IE2基因 ,并利用流式细胞仪分析。结果显示 ,转染了IE2基因的Jurkat wt p5 3细胞在瞬时转染 2 4h后出现光镜下可见的细胞凋亡改变 ,此时取样进行流式细胞仪测定细胞周期分布状况 ,可见转染了IE2基因的Jurkat wt p5 3细胞周期分布较其他各组发生了明显的变化 ,G1期和S期细胞分布减少 ,而G2 期细胞增多 ,细胞阻滞于G2 /M期 ,并且出现了细胞凋亡亚二倍体峰 ,引起细胞凋亡。研究表明 ,在Jurkat细胞中HCMV的IE2基因可介导野生型p5 3基因的促凋亡作用。

HCMV-IE1基因siRNA真核载体的构建及其效率研究

目的采用RNA干扰技术研究在体外对人巨细胞病毒即刻早期Ⅰ基因(HCMV-IE1)表达的沉默作用。方法根据HCMV-IE1基因表达框,设计siRNA干扰序列,重组至带U6启动子真核表达载体,构建针对HCMV-IE1基因的siRNA真核表达载体(pHCMV-IE1i);经测序鉴定后,脂质体法转染HEL细胞HCMVAD169株,应用荧光显微技术、流式细胞术和RT-PCR法检测分析pHCMV-IE1i对HCMV-IE1基因的表达干扰效果。结果测序结果显示针对HCMV-IE1基因的pHCMV-IE1i构建成功;荧光显微结果表明pHCMV-IE1i转入HEL细胞后可以特异抑制细胞中HCMV-IE1基因的表达;流式细胞术结果显示对照细胞组HCMV-IE1基因表达阳性率达60%以上,干扰细胞组HCMV-IE1基因表达阳性率仅达10%左右(P<0.05);RT-PCR检测结果发现pHCMV-IE1i能显著抑制HCMV-IE1基因的表达(P<0.05)。结论采用RNAi技术能有效抑制HCMV-IE1基因在细胞内的表达,对探讨其在防治HCMV感染疾病中的作用与意义提供了科学的实验依据。

体外感染后巨细胞病毒即刻早期基因转录及细胞结构变化的研究

目的：研究巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染后即刻早期基因转录及细胞结构的变化。方法：用ＨＣＭＶＡＤ１６９株感染人胚肺成纤维细胞，通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）动态检测感染后不同时间ＨＣＭＶ即刻早期基因（ＩＥＧ）ｍＲＮＡ转录，同时在电镜下观察细胞结构变化的特点。结果：ＨＣＭＶ感染细胞６ｈＩＥＧｍＲＮＡ开始转录，并持续到９６ｈ；感染初期（６～１２ｈ内）胞体肿胀，内质网（ＥＲ）囊腔膨大，１２～２４ｈ可见典型的“猫头鹰眼”样包涵体，细胞变圆，晚期（４８ｈ后）细胞灶性脱落，胞质退缩，ＥＲ少见，核中见待出核的成熟病毒颗粒。结论：ＨＣＭＶＩＥＧ在病毒复制过程中持续转录，并伴有细胞结构的病理变化，因此ＨＣＭＶＩＥＧ可作为病毒活跃复制的监测指标。

RNA干扰技术在体外抑制人巨细胞病毒基因表达的应用

目的探讨RNA干扰技术在体外抑制人巨细胞病毒(HCMV)基因表达时siRNA转染和病毒感染的先后顺序对抑制效果的影响。方法设计并化学合成靶向即刻早期(IE)基因的siRNA。应用阳离子脂质体法将siRNA导入人胚肺成纤维(HELF)细胞,并分为先转染siRNA后感染HCMV、先感染HCMV后转染siRNA以及同时转染siRNA和感染HCMV3组,同时设置正常对照组、阴性对照组、阳性对照组和转染试剂对照组。采用荧光定量PCR和琼脂糖凝胶电泳方法分别检测分析各组转染的siRNA对IE基因和阳性对照基因GAPDH的抑制效果。结果阳性对照组GAPDH基因mRNA表达量较阴性对照组和转染试剂对照组有明显下降,siRNA抑制率为70.4%,差异有统计学意义(P<0.05)。先转染si RNA后感染HCMV组、先感染HCMV后转染si RNA组、同时转染siRNA和感染HCMV组以及阳性、阴性、转染试剂对照组的IE基因m RNA表达量比较,差异有统计学意义(F=146.93,P=0.000)。其中先转染siRNA后感染HCMV组以及同时转染si RNA和感染HCMV组对IE基因m RNA表达的抑制效果均好于先感染HCMV后转染siRNA组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在体外,siRNA能有效抑制靶基因的表达,且先转染si RNA再感染病毒的抑制效果相对更好,提示siRNA对HCMV感染具有一定的预防作用。

HCMV基因在人和小鼠胚胎成纤维细胞中表达的差异性研究

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)种属特异性机制尚不清楚。研究通过检测HCMV AD169体外感染人胚胎成纤维细胞(Human embryo fibroblast,HEF)和小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)后病毒基因的表达情况,探讨HCMV种属特异性的可能分子机制。首先用HCMV AD169(MOI=5)分别感染HEF和MEF,相差显微镜逐日观察细胞的形态学变化;RT-PCR检测HCMV即刻早期(IE1、IE2)、早期(UL84)和晚期基因(UL83)的表达情况;Western-blot和免疫荧光检测病毒基因编码蛋白表达的情况。形态学观察发现HEF感染HCMV后逐渐变大变圆并相互融合,第4天可见典型的HCMV特征性病变效应,而MEF则未出现上述的变化;RT-PCR和Western-blot表明HEF组表达即刻早期基因IE1和IE2、早期基因UL84和晚期基因UL83 mRNA以及各基因所编码的蛋白,且相对表达量显著高于模拟感染组(P﹤0.01);而MEF组仅IE1和IE2 mRNA和蛋白相对表达量显著低于HEF组(P﹤0.05),而高于模拟感染组(P﹤0.01)。免疫荧光检测发现HEF感染72 h表达IE和UL83蛋白,而MEF则无明显表达。以上结果表明,HCMV不能在MEF中复制并产生完整子代病毒颗粒,且病毒基因表达阻止在IE2基因表达之后和UL84基因表达之前,其种属特异性可能与即刻早期蛋白低水平的表达量有关。

真菌菌丝体提取物抑制人巨细胞病毒基因转录水平的研究

目的研究真菌菌丝体提取物对人巨细胞病毒基因转录的抑制作用,探讨其抗HCMV效果及其机制。方法建立抗HCMV细胞模型,用半定量PCR检测细胞感染后不同时间UL122、UL123、UL44、UL57、UL86mRNA表达量的变化。结果 UL122、UL123mRNA的表达高峰为HCMV感染细胞后24h,UL44、UL57mRNA的表达高峰为感染后96h,UL86mRNA的表达高峰为感染后120h。真菌菌丝体提取物与HCMV作用后接种细胞及HCMV接种细胞后加入真菌菌丝体提取物24h检测UL122、UL123mRNA的表达量均显著降低。而病毒完成穿入过程后加入50μg/ml真菌菌丝体提取物与加入5μg/ml组相比UL122、UL123mRNA表达量更少。HCMV进入细胞6h后加入真菌菌丝体提取物再培养96h,UL44、UL57mRNA的表达量无显著变化。HCMV进入细胞24h后加入真菌菌丝体提取物再培养120h,UL86mRNA的表达表达量无显著变化。结论真菌菌丝体提取物可显著抑制HCMV AD169毒株IE基因(UL122、UL123)的转录,导致其mRNA表达显著降低,且抑制作用存在量效关系;但对E基因(UL44、UL57)和L基因(UL86)转录水平抑制作用不明显,表明真菌菌丝体提取物抗HCMV的重要作用机制是通过抑制HCMV IE基因的转录和翻译,进而抑制病毒的复制增殖。

人巨细胞病毒感染及Bcl-2表达与结直肠癌相关性研究

目的探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染在结直肠癌发生、发展过程中可能的作用机制。方法收集50例结直肠癌患者的病理肿瘤组织标本,同时收集距离肿瘤组织手术切缘10cm以上的自身瘤旁正常肠粘膜组织为对照,应用RT-PCR技术检测组织中HCMV的感染情况,免疫组化技术检测凋亡相关基因Bcl-2的表达水平。结果肿瘤组及瘤旁组HCMV IE2阳性率分别为40.00%(20/50)和6.00%(3/50),差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2阳性率分别为36.00%(18/50)和8.00%(4/50),差异有统计学意义(P<0.05)。50例HCMV阳性肿瘤组织Bcl-2阳性率高于HCMV阴性肿瘤组织,肿瘤组织Bcl-2表达水平与HCMV感染呈线性相关(χ2=5.834,P<0.05)。结论 HCMV感染是结直肠癌发生、发展的相关因素之一,其作用机制与影响Bcl-2的表达有关。

人巨细胞病毒体外感染人胚肺成纤维细胞后相关基因的表达

目的研究人巨细胞病毒（HCMV）体外感染人胚肺成纤维细胞（HELF）后即刻早期基因（UL122和UL123）、早期基因（UL54）和晚期基因（UL83）的表达情况,探讨其时序性表达关系。方法用高感染复数的HCMV AD169病毒株感染体外培养的HELF,在感染后0.5 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h、12.0 h和24.0 h收获细胞,Trizol法提取各样本总RNA,并进行反转录反应,实时荧光定量PCR方法检测各时刻UL122、UL123、UL54和UL83基因mRNA表达量。结果 1.HCMV UL122 mRNA在感染后0.5 h即开始表达,在感染后2.0~4.0 h mRNA表达量迅速增高,然后进入平台期（6.0~12.0 h）,此后略有升高;除感染后6.0 h和12.0 h外,余各时间点其表达差异均有统计学意义（Pa〈0.01）。2.HCMV UL123 mRNA在感染后0.5~6.0 h表达量迅速升高,此后增速变缓,略有升高。除12.0 h与6.0 h和24.0 h表达量无差异外,余各时间点差异均有统计学意义（Pa〈0.01）。3.HCMV UL54 mRNA在感染后0.5~2.0 h表达量较少,4.0~6.0 h明显增多,12.0~24.0 h持续增高。除0.5 h与2.0 h、6.0 h与12.0 h表达无显著差异外,余不同时间点差异均有统计学意义（Pa〈0.05）。4.HCMV UL83 mRNA在感染后0.5~4.0 h呈低水平,6.0 h后明显增多,此后持续增高;除前3个时间点外,余均有统计学差异（Pa〈0.05）。结论 HCMV AD169株各基因mRNA呈级联时序性表达,UL122和UL123、UL54及UL83 mRNA开始表达的时相分别为感染后0.5~4.0 h、2.0~4.0 h和6.0~12.0 h,与各基因间连锁调控表达相一致。

人巨细胞病毒IE1-72蛋白在胶质瘤中的表达及意义

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)立刻早期基因1-72(IE1-72)蛋白在胶质瘤中的表达水平以及HCMV感染与胶质瘤发生的病因学关系。方法:采用免疫组化方法检测HCMV IE1-72蛋白在125例人脑胶质瘤组织及10例正常人脑组织中的表达,分析其表达水平与胶质瘤临床病理学特征的关系。结果:IE1-72蛋白在胶质瘤组织中的表达水平明显高于正常人脑组织(P=0.000);IE1-72蛋白免疫染色强度随胶质瘤病理级别的升高而明显增强(r=0.310,P=0.000),其在高恶性度胶质瘤中的染色强度明显强于低恶性度胶质瘤(P=0.004);IE1-72蛋白染色强度与胶质瘤患者的年龄存在正相关(r=0.234,P=0.009),而与胶质瘤患者的性别(r=0.038,P=0.675)以及肿瘤部位(r=0.086,P=0.341)无明显相关性。结论:HCMV感染及其蛋白IE1-72表达可能与人脑胶质瘤的发生和发展密切相关,但其确切的致瘤机制尚需进一步研究。

巨细胞病毒IE2的红色靶基因与绿色荧光-慢病毒系统的建立及其对人神经干细胞的感染

目的 RNA干扰技术沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因巨细胞病毒IE2的表达,并初步研究慢病毒感染神经干细胞的可能性。方法以人巨细胞病毒IE2 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向巨细胞病毒IE2的shRNA表达质粒,构建携带IE2的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞。通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western Blot确定最佳沉默IE2序列后,将有效的UTG-IE2质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,获取高滴度慢病毒。应用慢病毒感染人神经干细胞,观察神经干细胞被慢病毒感染的情况并检测神经干细胞的绿色荧光表达情况。结果成功构建IE2-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-IE2,RT-PCR及Western Blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞IE2 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低。构建的慢病毒可以成功感染神经干细胞。结论红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率,可实现慢病毒介导的RNA干扰在神经干细胞内的有效表达,并为相关研究提供技术支持。

静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(pH4)体外药效学研究

目的实验室确认静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(pH4)(human cytomegalovirus immunoglobulin for intravenous injection,CMV-IVIG)抑制巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)感染的有效性。方法分别通过免疫荧光染色和细胞病变实验测定CMV-IVIG抑制CMV的即早基因1表达和致细胞病变能力,确认CMV-IVIG有效性。结果即早基因1表达量与病变细胞数量随着制品稀释倍数的增加而增加;27倍稀释的CMV-IVIG可抑制90.77%~95.85%的CMV感染力;103倍稀释的CMV-IVIG可抑制>90%的细胞病变。结论 CMV-IVIG中的中和抗体能特异性中和CMV,阻止CMV感染细胞,且具有良好的量效关系。