高密度脂蛋白对THP-1巨噬细胞B类Ⅰ型清道夫受体的表达及胆固醇流出的影响

目的:观察高密度脂蛋白(HDL)对THP-1巨噬细胞B类Ⅰ型清道夫受体(SR-BI)的表达及胆固醇流出的影响。方法:用HDL及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理THP-1细胞,采用RT-PCR、Western印迹及液体闪烁计数法观察细胞SR-BI的表达及细胞内胆固醇流出的变化。结果:ox-LDL下调THP-1巨噬细胞中SR-BI的表达,而HDL则上调THP-1巨噬细胞中SR-BI的表达;液体闪烁计数法检测发现ox-LDL减少细胞中胆固醇的流出,HDL可以增加细胞胆固醇的流出,且HDL的效应呈浓度依赖性。结论:HDL可能通过上调THP-1巨噬细胞SR-BI的表达,促进巨噬细胞内胆固醇流出。

mm-LDL对內皮细胞转录因子NF-kB活性的影响

目的 研究轻微修饰低密度脂蛋白(mm-LDL)激活内皮细胞转录因子NF-kB的信号传导途径以及NF-kB对血小板源性生长因子B链(PDGFb)表达的调控作用。方法 以FeSO4修饰法制备mm-LDL，以正常LDL(n-LDL)作对照，作用于培养内皮细胞后提取核蛋白，用凝胶阻滞实验检测转录因子NF-kB核转位及结合活性的变化。观察自由基清除剂probucol及PDTC对mm-LDL激活内皮细胞转录因子NF-kB的影响。通过检测报告基因探讨核因子诱导激酶（NIK）和核因子-kB抑制亚基激酶(IKK)在激活内皮细胞转录因子NF-kB的信号传导途径中的作用以及mm-LDL激活的NF-kB对PDGFb基因启动子的作用。结果 mm-LDL能激活培养内皮细胞转录因子NF-kB, 自由基清除剂probucol和PDTC对mm-LDL激活内皮细胞转录因子NF-kB无明显抑制作用。变异型NIK及IKK能显著降低报告基因荧光素酶的活性，mm-LDL激活的NF-kB还能增加带有PDGFb基因上游调控序列（-189/＋43）的报告基因荧光素酶的活性。Slot blot结果显示变异型NIK能显著减少受mm-LDL刺激的内皮细胞 PDGFb mRNA含量。结论 mm-LDL可通过NIK-IKK途径激活内皮细胞转录因子NF-kB并促进PDGFb基因表达。

循环内皮微粒相关microRNA在巨噬细胞炎性反应诱发小鼠动脉粥样硬化发生的机制

目的研究循环内皮微粒(EMPs)相关microRNA在巨噬细胞炎性反应诱发动脉粥样硬化(AS)发生的作用机制。方法 SPF级雄性ApoE-/-小鼠206只,对照组50只,实验组随机分为动脉粥样硬化模型(AS模型)组、NC-miRNA组和miRNA-19b抑制剂组,每组52只。采用油红染色对AS病变小鼠的组织学进行观察,计算斑块面积相对比例;检测生化指标的表达水平,主要包括小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG);ELISA检测血管炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6和IL-10的变化;Western blot检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤因子(Bcl-2)、细胞凋亡的标志蛋白PARP降解产物(cleaved-PARP)和B细胞淋巴瘤因子相关X蛋白(Bax)表达的变化,实时荧光定量PCR检测miR-19b表达;流式细胞法检测巨噬细胞的凋亡率。结果 miRNA-19b抑制剂组可减少由于AS引起的血管厚度增加,减少AS斑块面积比例;使血脂中的TC、TG和LDL-C水平降低,HDL-C水平则有升高;Bax、cleaved-PARP促相关的凋亡蛋白表达量下调,同时Bcl-2抗凋亡蛋白表达上调;血管中促炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α水平降低,抗炎症因子IL-10的水平则升高;同时使血管内巨噬细胞的凋亡率下降。结论 EMPs相关miRNA-19b的存在可以减少巨噬细胞的凋亡,并且通过上调促炎因子促进组织周围炎症的发生,进而促进AS的发展进程。

循环内皮微粒相关microRNA在巨噬细胞炎性反应诱发动脉粥样硬化发生中的作用机制

目的研究循环内皮微粒相关microRNA在巨噬细胞炎性反应诱发动脉粥样硬化(AS)发生的作用机制。方法选取实验组和对照组SPF级5周小鼠各50只。实验小鼠分4组:对照组、动脉粥样硬化模型组(AS模型组)、NC-miRNA组和miRNA-19b抑制剂组,采用油红染色对AS病变的组织学进行观察,计算斑块面积相对比例,并检测生化指标的表达水平,主要包括血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG),ELISA检测血管炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10的变化,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、cleaved-caspase-3和Bax表达的变化,实时荧光定量PCR检测miR-19b表达,流式细胞法检测巨噬细胞的凋亡率。多组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析,两两比较采用LSD-t检验。结果各组胸腔动脉斑块面积百分比:对照组为(0.00±0.00)﹪;AS模型组为(9.59±6.53)﹪;NC-miRNA组为(8.96±3.47)﹪;miRNA-19b抑制剂组为(3.21±2.03)﹪,三组间比较差异有统计学意义(F=20.572,P=0.002)。与对照组比较,AS模型组和NC-miRNA组TC[AS模型组(3.26±0.21)mmol/L;NC-miRNA组(3.13±0.14) mmol/L;F=13.994,P=0.002]、TG[AS模型组(0.25±0.06)mmol/L;NC-miRNA(0.21±0.02) mmol/L;F=11.230,P=0.011)]和LDL-C [AS模型组(1.65±0.11) mmol/L;NC-miRNA (1.59±0.27) mmol/L;F=10.069,P=0.006)]水平升高,而HDL-CAS模型组[(0.08±0.09) mmol/L;NC-miRNA (0.08±0.05) mmol/L;F=12.450,P=0.004)]水平含量降低。与模型组比较,miRNA-19b抑制剂组TC(1.85±0.06) mmol/L、TG(0.15±0.03) mmol/L和LDL-C(1.21±0.10) mmol/L水平降低,HDL-C (0.11±0.05) mmol/L水平则升高(P均<0.05)。AS模型组与对照组相比,IL-1(34.06±3.58)g/L、IL-6(92.57±31.97)g/L和TNF-α(63.01±15.65) g/L水平升高,而IL-10(16.86±1.29)g/L的水平降低,NC-miRNA组各指标亦有相同的变化趋势;miRNA-19b抑制剂组IL-1(24.85±6.21) g/L、IL-6(53.29±17.15) g/L和TNF-α(34.51±6.47)g/L水平低于AS模型组和NC-miRNA组(F=13.671,P=0.002),IL-10(24.94±4.72) g/L的水平则高于两组(F=13.675,P=0.008)。和对照组相比,AS模型组和NC-miRNA组的Bax(AS模型组3.39±0.01;NC-miRNA组0.64±0.02;F=26.910,P=0.000)和cleaved-PARP (AS模型组2.47±0.05;NC-miRNA组3.27±0.01;F=13.226,P=0.000)表达量升高。但Bcl-2(AS模型组0.67±0.02;NC-miRNA组0.64±0.02;F=12.585,P=0.000)表达水平下调。与NC-miRNA组相比,miRNA-19b抑制剂组的促细胞凋亡的蛋白Bax(2.16±0.02)和cleaved-PARP(1.91±0.04)表达水平下调,Bcl-2(1.05±0.01)的表达水平上调。与对照组比较,AS模型组(2.71±0.02)和NC-miRNA组(2.43±0.02)的miRNA-19b的转录水平增加,差异有统计学意义(P均<0.05),miRNA-19b抑制剂组(1.52±0.01)转录水平有升高,但相较于AS模型组和NC-miRNA组的变化其增加量不显著,(F=15.353,P=0.002)。miRNA-19b基因转录水平:对照组为1.02±0.03;AS模型组为2.71±0.02;NC-miRNA组为2.43±0.02;mi RNA-19b抑制剂组为1.52±0.01(P均<0.05)。细胞凋亡率:对照组为(4.41±0.18)﹪;AS模型组为(7.16±0.73)﹪;NC-miRNA组为(6.29±0.24)﹪;miRNA-19b抑制剂组为(5.01±0.11)﹪,(F=12.889,P=0.008)。结论 miRNA-19b抑制剂可以减少巨噬细胞的凋亡,降低促炎症因子,可减少由于AS引起的血管厚度的增加,减少AS斑块的面积比例,使血脂中的TC、TG和LDL-C水平降低,HDL-C水平则有升高,这对冠心病的临床诊疗具有重要的临床指导意义。