顺式串联家蝇抗菌肽Attacin基因真核表达载体的构建

目的构建家蝇抗菌肽Attacin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法PCR法扩增家蝇抗菌肽Attacin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ位点,下游5′端带有NotⅠ和xbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T栽体,利用pMD18-T载体的Nde Ⅰ位点和目的片断上的一对同尾酶(Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Attacin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和Not Ⅰ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果 PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明串联体基因重组质粒构建成功。结论该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。

家蝇Attacin基因在家蝇三龄幼虫中的时间表达模式研究

目的探讨家蝇Attacin mRNA在幼虫各个时期的表达,为进一步研究家蝇的免疫防御打下基础。方法对家蝇三龄幼虫进行诱导,分别取诱导前0h和诱导后2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h、48h的家蝇mRNA,进行RT-PCR,分析attacin基因在家蝇体内的时间表达模式。结果家蝇三龄幼虫体内的attacin基因在诱导前后均有表达,诱导后表达增强16h达到相对高水平,维持约24h,而后开始下降。结论Attacin基因在家蝇三龄幼虫中是组成性表达,对进一步了解其在家蝇免疫系统,丰富对昆虫天然免疫的认识具有积极作用。

家蚕抗菌肽Attacin基因植物表达载体的构建

抗菌肽是昆虫抵御外界微生物侵染的主要物质。利用双酶切将pBI121载体上的植物启动子CaMV35S克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,构建重组表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S。通过PCR扩增家蚕抗菌肽attacin基因编码区全长序列,并将其成功克隆至T载体上(Gen Bank登录号:GU244351),然后利用双酶切将attacin基因亚克隆到pCAMBIA2300-CaMV35S上,通过PCR鉴定,成功构建了attacin基因的植物表达载体pCAMBIA2300-Ca MV35S-attacin。为研究attacin基因在植物抗病性方面的应用奠定基础。