大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的克隆大鼠肝再生增强因子基因编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从 2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片段亚克隆到pBV2 2 1质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约 4 0 0bp的肝再生增强因子cDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约 15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从 2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 ,并获得了原核细胞高效表达。

脐血干细胞移植与肝再生增强因子联合治疗急性肝衰竭的实验研究

目的观察脐血干细胞移植与肝再生增强因子联合治疗急性肝衰竭大鼠的疗效,以期为肝脏组织工程修复提供依据。方法建立肝衰竭大鼠模型40只,按照随机数表法将大鼠随机分为对照组(采用腹腔注射生理盐水)、脐血干细胞移植组(移植组,采用腹腔移植2×107脐血干细胞)、脐血干细胞移植联合肝再生增强因子组(联合组,采用腹腔移植2×107脐血干细胞联合注射肝再生增强因子50μg·kg-1·d-1)和肝再生增强因子组(增强因子组,采用腹腔注射肝再生增强因子50μg·kg-1·d-1),每组各10只。用DAPI标记肝细胞。大鼠肝衰竭造模成功后,经治疗一个月后分别取四组大鼠的肝组织制作冰冻切片,并于荧光显微镜下观察肝组织中DAPI标记的细胞计数。结果移植组肝脏归巢及定植的干细胞为(12.6±2.0)个细胞/100倍视野,多于增强因子组的(8.1±3.4)个细胞/100倍视野,差异有统计学意义(P<0.05),增强因子组到肝脏归巢及定植的干细胞又多于对照组的(3.1±3.4)个细胞/100倍视野,差异有统计学意义(P<0.05),而联合组肝脏归巢及定植的干细胞为(18.1±3.4)个细胞/100倍视野,多于以上各组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同干预手段对脐血干细胞归巢、定植于肝脏有一定影响,联合组的干细胞归巢率优于单行移植组和增强因子组。因此脐血干细胞移植联合肝再生增强因子是一种较为理想的急性肝衰竭治疗手段。

人肝脏再生增强因子对体外肝细胞生长的影响

目的基因工程方法纯化人肝脏再生增强因子(hALR),研究hALR对体外培养肝细胞生长的影响。方法构建hALR原核表达载体PGEX-3X-hALR,诱导表达、纯化收集GST-hALR,用X因子切去GST,凝胶过滤得到高纯度hALR蛋白;分别用正常肝细胞(L-02细胞)和肝癌细胞(HepG2细胞)分析hALR对其生长的影响。结果hALR原核表达载体pGEX-3X-hALR构建成功,经诱导表达,可纯化得到高纯度的hALR蛋白。hALR蛋白能促进正常肝细胞的生长,并与浓度成正相关;而肝癌细胞的生长却起抑制作用。结论成功表达和纯化重组hALR蛋白,hALR促进正常肝细胞的生长而抑制肝癌细胞生长。

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的克隆大鼠肝再生增强因子 (ALR)编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT_PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片断亚克隆到pBV221质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的ALRcDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 。

人肝再生增强因子的克隆及表达

根据同源克隆的原则，依照大鼠ALRcDNA编码区两端核苷酸序列合成一对引物，以人胎肝细胞mRNA的RT产物为模板扩增出一条380bpcDNA片段，测序结果表明与大鼠ALR有85％同源性，将人ALRcDNA插入PBV220质粒转化E．coliJM109感受态细胞，筛选到的阳性克隆经温度诱导后，SDS-PAGE结果表明目的蛋白含量占菌体总蛋白的25％左右。

肝脏再生增强因子cDNA的克隆及稳定细胞株的建立

目的通过对人源肝脏再生增强因子(ALR)cDNA进行克隆及活性的初步鉴定,为基因工程制备重组人肝脏ALR(hALR)提供资料。方法提取人胎肝总RNA,通过RT-PCR获得hALR cDNA,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ALR,转化大肠杆菌扩增质粒。将质粒pcDNA3.1与pcDNA3.1-ALR分别转染HepG2细胞,G418筛选建立稳定细胞株,MTT法检测hALR的生物学活性。结果测序证实克隆得到的hALR序列完全正确。MTT比色结果,转染hALR的细胞增殖高于转染空质粒和未转染细胞(P<0.05)。结论hALR具有促肝细胞增殖的作用。