出芽短梗霉菌株PA-2胁迫下藜qRT-PCR内参基因的筛选与验证

为筛选适合出芽短梗霉菌株PA-2胁迫下藜中稳定表达的内参基因,在转录组数据(NCBI登录号为:SRA:SRR12674257)分析的基础上,以PA-2不同时间胁迫的藜叶片为材料,分析藜中ACT-1、TUB-1、GAPDH、eEF1α、eIF3、UBQ、PTB、COX10、UPL6、TIP41L、RAN-B1和IDH-5等12个内参基因的表达水平,并利用ΔCt、GeNorm、NormFinder、BestKeeper及RefFinder分析候选内参基因的表达稳定性。结果表明,内参基因COX10是PA-2不同时间胁迫下藜中最稳定的内参基因,最优组合是COX10+eEF1α。通过分析藜ACC基因的相对表达水平,验证了内参基因的可靠性,为今后杂草藜胁迫响应基因的表达分析提供了参考基因和理论依据。

出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基及发酵条件优化

【目的】优化出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)PA-2菌株产孢发酵培养基和发酵条件,以提高PA-2菌株的产孢量,为该菌的开发和生产应用提供理论依据。【方法】以PA-2菌株发酵液中的产孢量为检测指标,采用单因子优化PA-2菌株发酵培养基和最佳发酵条件,通过中心组合设计(Central composite design,CCD)筛选培养基成分最佳配比;用PA-2菌株制成可湿性粉剂用于杂草藜田间防除试验。【结果】经优化后,PA-2菌株产孢最佳培养基配方为葡萄糖84.60 g/L、大豆粉46.35 g/L、NaCl 2.59 g/L、MgSO4 0.52 g/L、KCl 0.78 g/L、K2HPO4 6.50 g/L、(NH4)2SO4 0.52 g/L;最佳发酵条件为pH 7、温度25 ℃、装液量60 mL/250 mL、转速180 r/min、接种量8%、培养时间120 h。田间防除试验结果表明,PA-2可湿性粉剂对杂草藜的鲜重防效最高可达75.0%。【结论】优化后的培养和发酵条件可有效提高PA-2菌株的产孢量,降低发酵成本,适合发酵放大试验及相关剂型的开发研究;可采用PA-2菌株生产菌剂应用于杂草防除。

出芽短梗霉菌PA-2脂肽类物质抑菌活性及其发酵条件优化

探究出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)PA-2脂肽类物质的抑菌活性,并以脂肽类物质的产量为响应值对其发酵条件进行优化,为脂肽类物质的生产与应用奠定理论基础。采用酸沉淀法对脂肽类物质进行粗提,通过原位酸水解-茚三酮显色法对脂肽粗提物进行定性检测,并用琼脂打孔扩散法对其抑菌活性进行测定,通过中心组合设计(central composite design,CCD)构建响应面对其发酵条件进行优化。最终初步判定粗提物为环状脂肽类物质;该物质对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、樱桃球腔菌(Mycosphaerella cerasella)和大麦网斑病(Pyrenophora teres)具有明显的抑制作用,抑菌圈分别为3.65、1.95、2.15、1.35、2.18 cm;优化后的最适发酵条件为:接种量6.8%、转速216 r·min^(-1)、温度26℃、装液量125 mL、pH 7。在此条件下模型预测的脂肽类物质产量为0.94 g·L^(-1),实际为0.92 g·L^(-1),比优化前的产量(0.61 g·L^(-1))提高了51%。优化后的发酵条件可提高脂肽类物质产量,降低发酵成本,可用于上述有抑制效果的菌株防治。

出芽短梗霉菌PA−2侵染对藜叶片代谢的影响

为探明出芽短梗霉菌Aureobasidium pullulans PA−2侵染对藜Chenopodium album叶片代谢影响,采用基于液相色谱−质谱联用技术(LC−MS)的代谢组学方法,对出芽短梗霉菌PA−2侵染藜叶片差异代谢产物进行分析。结果表明,通过正交偏最小二乘法判别分析(OPLS−DA),PA−2孢子处理藜叶片24 h后和处理前两组共筛选到185个具有显著差异(VIP>1,P<0.05)的代谢产物,其中有148个上调,37个下调,腺苷和甜菜碱可以作为24 h后的主要生物标志物。KEGG通路富集分析发现,这些差异代谢物主要富集在全局和概述地图、氨基酸代谢、碳水化合物代谢通路等3条代谢通路中。藜叶片中嘌呤代谢、次级代谢产物生物合成、氨基酸代谢和碳水化合物代谢变化可能是PA−2侵染藜的主要机制。本研究为进一步研究出芽短梗霉菌侵染藜的生防机制提供了理论基础。

出芽短梗霉菌PA-2对藜叶片生理生化的影响

为明确出芽短梗霉菌PA-2侵染对藜叶片生理生化代谢的影响,通过试剂盒法测定了对照组(CK)、盆栽试验组及田间试验组藜叶片保护酶、丙二醛、叶绿素、可溶性蛋白和可溶性糖含量,电镜下观察了藜叶片细胞超显微结构的变化。结果表明:相对于CK,盆栽组和田间组藜叶片内叶绿素、可溶性蛋白质、可溶性糖含量以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在PA-2侵染下呈现总体下调趋势;在接种第3天,观察到藜细胞内叶绿体形状畸形,胞内结构不完整、外膜逐渐解体。本研究为解析出芽短梗霉菌PA-2对藜侵染的分子机理提供参考。

藜叶片响应出芽短梗霉菌侵染内参基因筛选及光合作用相关基因表达分析

【目的】筛选适合出芽短梗霉菌株PA-2侵染藜的稳定表达的最适内参基因,并进行PA-2侵染下藜光合作用相关基因的表达分析验证。【方法】分别以菌株PA-2孢子侵染0、1、3、5、7 d的藜叶片和正常生长藜的根、茎、叶为供试材料,通过qRT-PCR技术和Ct值评估3个候选内参基因GAPDH、β-ACTIN、β-TUBULIN的表达稳定性,并利用筛选出的内参基因,对藜光合作用相关基因(LFRN、MDH、PetC、psaA、CAB40、psaN、BHY和MO_(2))的表达水平进行定量分析。【结果】在菌株PA-2侵染藜不同时间点和不同组织的样本中,藜最适内参基因为GAPDH,可用于后续分析光合作用相关基因的表达水平。以GAPDH作为内参基因检测8个光合作用相关基因的表达水平,在不同侵染时间点,8个光合作用相关基因的表达量均出现不同程度的下调,除MDH基因外,其余基因均在5 d时达到最低水平。其中PctC、psaN、CAB40、BHY、MO_(2)基因在藜受侵染0~1 d中下调表达,在3 d达到较高水平,后期表达量下调;pasA先上调表达后下调表达;LFRN在受侵染后持续下调表达;MDH在受侵染后先显著下调,在3 d达到较低水平,后上调表达。在藜受侵染的不同组织中,8个基因在藜叶中均有大量表达,其中MDH基因在茎中大量表达,PctC和CAB40在根中表达量最低,除MDH基因外,其余7个基因在不同组织中的表达量高低排序为:叶>茎>根。【结论】本研究为后续利用qRT-PCR分析藜基因表达及研究PA-2致病机理奠定基础。

出芽短梗霉菌株PA-2侵染藜叶片的转录组分析

藜(Chenopodium album)是一种极具竞争力的一年生世界性杂草。为了探究出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株PA-2侵染藜的分子机制,利用RAN-seq技术分析PA-2侵染藜叶片0 (CK)、1 (T1)、3 (T3)、5(T5)、7 (T7) d的转录组差异。基于转录组数据组装,共得到69 404条Unigene,其中50.13%的序列在KEGG、NR、COG以及SwissProt四大数据库中得到注释。利用GO数据库对差异表达基因进行分析,结果发现差异表达基因主要富集在质体、类囊体、叶绿体、细胞膜以及氧化还原酶活性等方面。利用KEGG数据库对差异表达基因影响的通路进行注释后发现,PA-2侵染主要影响了植物MAPK信号通路、植物病原体相互作用、苯丙烷生物合成和植物激素信号转导等途径中关键基因的表达水平。经PA-2处理后,通过转录组测序筛选出与叶绿体相关的差异基因主要集中在光系统Ⅱ(PSⅡ),分别是psbY、psbB以及psbO基因,其次是与碳固定过程紧密相关的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPB)和果糖二磷酸醛缩酶(FBA3)的基因,影响叶绿体膜流动性的乙酰辅酶A羧化酶(BCCP1)以及影响可溶性糖含量的葡聚糖水二激酶(GWD1)。研究结果初步明确了菌株PA-2防除藜的分子机制,为PA-2生物除草制剂商品化以及杂草的生物防治奠定一定的理论基础。