多角体病毒琼脂免疫双扩散和ELISA检测研究

用提纯的SpltNPV、AcNPV病毒粒子分别为免疫抗原获得抗血清,以此抗血清为抗体,提纯的SpltNPV、AcNPV多角体裂解所得粗提纯病毒粒子为检测抗原,初步建立两种病毒的琼脂免疫双扩散法和ELISA间接检测方法。琼脂免疫双扩散结果表明:所得抗血清能识别粗提抗原,但不能与细胞培养的病毒粒子反应。两种病毒I-ELISA检测灵敏度分别达11.23、11.67 ng。

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm 。

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)大立方形多角体突变株的分子生物学研究

利用空斑技术，从既能形成多角体又含ＴＫ酶基因的苜蓿丫纹夜蛾重组核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫ中，纯化了一株形成大立方形多角体的病毒突变株ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫｍｔ５１３。用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＢｇｌⅡ及ＫｐｎⅠ等限制性内切酶对它做了酶切分析，并克隆了多角体蛋白全基因及其侧翼部分的片段。对所克隆的部分全序列测定结果，发现在多角体蛋白基因读码框内只出现了一个碱基的突变，导致了第２５位的氨基酸密码子由ＧＧＴ变为ＧＡＴ，该位氨基酸由甘氨酸（Ｇｌｙ）变为天冬氨酸（Ａｓｐｑ）还利用ＰＣＲ技术扩增出突变了的多角体蛋白基因部分片段，并将它克隆入转移载体质粒ｐＥＶ５５，与不形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＨＢｓＤ４ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞，结果产生同样的大立方形多角体病毒。

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫及成虫的影响

分别研究了甜菜夜蛾在幼虫期和成虫期对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的敏感性.结果表明,AcNPV对4龄甜菜夜蛾幼虫的致死中浓度为1 ml 9.1×106 PIB(多角体),4龄幼虫摄入亚致死剂量病毒对化蛹产生不良影响,并使性比发生变化,雌雄蛹比为0.6～0.8,较对照明显升高;幼虫期摄入病毒亦对其成虫的繁殖力产生影响,无论是每雌产卵量、总卵量还是卵孵化率均比对照显著降低,交配比例和次数也比对照明显下降.甜菜夜蛾成虫期摄入病毒亦对繁殖力产生影响,产卵量和交配比例和次数以及卵孵率均比对照明显下降,此外,还对后代幼虫的存活率有显著影响.

应用昆虫杆状病毒载体在昆虫细胞中表达乙肝表面抗原

人乙型肝炎病毒（ａｄｒ亚型）表面抗原Ｓ基因克隆到ＰｕＡＣ－５苜蓿尺蠖核型多角体病毒转移载体上，所构建的重组转移载体质粒与野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ共转染Ｓｆ－２１细胞，经空斑法筛选和纯化，得到了含ＨＢＶＳ基因的重组病毒ＡｃＮＰＶＳ．用放射免疫法测定了ＡｃＮＰＶＳ感染的Ｓｆ－２１细胞及其培养液中的ＨＢｓＡｇ，总表达量为１．２２μｇ／１０￣６细胞．

一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中分别克隆出其P10基因。从BmNPV P10中亚克隆得到其5′端上游片段,经PCR定位突变使之ATG区突变成一个BglⅡ酶切位点。从AcMNPVP 10中亚克隆得到基因3′端下游片段,克隆入经突变的BmNPV P10基因启动子的下游,构建成一个新的转移表达载体pBmAcPV-1,由于BmNPV和AcMNPV P10基因及两端的同源性高达90％以上,该载体可以分别与野生型BmNPV和AcMN-PV DNA进行同源重组。

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒囊膜内核衣壳排列图式的电镜观察

The arrangement patterns of nucleocapsids within the envelope of \%Autographa californica\% nuclear polyhedrosis virus were studied by electron microscopy. Numbers of nucleocapsids observed in an envelope in their cross sections ranged from 1 to 17, and the frequencies at 2,3,4,5,6 and 7 nucleocapsids were significantly higher than the others, suggesting that these numbers of nucleocapsids were more commonly involved in an envelope. The regular arrangement patterns of nucleocapsids within envelope were observed in cross sections. Envelope outlines can be classified into a triangle (3 nucleocapsids in an envelope),lozenge and square (4 nucleocapsids in an envelope), trapeziun (5 nucleocapsids in an envelope), pentagons (5 or 8 nucleocapsids in an envelope) and hexagons (7 or 10 nucleocapsids in an envelope). The irregular arrangement patterns of nucleocapsids within envelopes were also observed in cross sections.

家蚕核型多角体病毒gp64基因的定位及克隆

以苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ的膜表面糖蛋白基因ｇｐ６４作为探针，对经不同内切酶酶切的家蚕核型多角体病毒基因组ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，发现ＢａｍＨⅠ酶切产生的４．２ｋｂ和７．６ｋｂ片段呈阳性杂交，经ＤＮＡ片段回收，将４．

粉纹夜蛾细胞系QB-Tn9-4s的克隆以及克隆株生物学特性的研究

对粉纹夜蛾Trichoplusiani细胞系QB-Tn9-4s进行细胞克隆,获得了8个细胞克隆株,分别命名为QB-Tn-A、B、C、D、E、F、G和H。对基因组DNA进行RAPD-PCR鉴定,各细胞克隆株与原始细胞系具有相同的DNA扩增谱带。各细胞克隆株在形态和生物学特性方面表现出一定的差异。克隆株QB-Tn-A、B、C、D和E以梭形细胞为主,大约占细胞总数的60%～80%;F、G和H以棒状细胞为主,比例分别为44.5%、49.5%和80.0%。8个克隆株对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)均较敏感,感染率均在92%以上,平均每个细胞病毒多角体(OBs)产量在78～110个之间,其中克隆株QB-Tn-A多角体产量最高达110个,略高于BTI-Tn5B1-4和QB-Tn9-4s,明显高于Sf-9细胞;克隆株QB-Tn-E、H、A和C的出芽性病毒(BV)产量与原始细胞系(3.37×107TCID50/mL)接近,而其它4株均低于原始细胞系。

人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达

人尿激酶原(pro-urokinase,pro-UK)是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性。为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达pro-UK,我们在pAc373基础上,插入野生型AcMNPV polyhedrin启动子区-7～1碱基序列,构建了一个高表达转移载体pAcYT。分别经三次克隆将pro-UK cDNA正向插入到转移载体pAc373或PAcYT的BarnHI-KpnI位点上。用LiPofectin将pAcyT-UKDNA或pAc373-UK DNA与AcMNPV DNA共转染到昆虫Sf9细胞中,空斑法筛出重组病毒阳性克隆株。高效表达结果是:1.ELISA法确定重组病毒Sf9细胞分泌表达产物pro-UK为96mg/L培养基上清,平板法测定溶圈活性为1600IU/mL培养基上清;2.亲和层析一步法纯化表达产物,回收率选70％,以上,比活约为60000IU/mg;3.纯化的pro-UK,无论是否经还原处理,其SDS-PAGE图谱均为相同的单一条带,MR 50000;4.Western blot与SDS-PAGE图谱吻合。

三株烟草天蛾新细胞系的生长特性及重组蛋白表达

从尚未涉及的昆虫种类中建立新的细胞系能为基础研究和生物技术应用提供重要资源。本实验通过细胞培养技术,建立了3株来源于鳞翅目昆虫烟草天蛾Manduca sexta卵组织的新细胞系,分别命名为QB-Ms1-8,QB-Ms2-2和QB-Ms2-7。这3株细胞已经培养在TNM-FH培养基中,28℃条件下传代培养了约50代,大部分细胞呈梭形,细胞群体倍增时间分别为51,31和49h。虽然这3株细胞系对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)不够敏感,侵染后96h感染率在33%～40%之间,但是QB-Ms2-2细胞与BTI-Tn5B1-4细胞比较,分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性表达更高。本研究从建立的3株烟草天蛾新细胞系中筛选出SEAP高表达的细胞系QB-Ms2-2,为进一步细胞克隆和筛选提供了新资源。

大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因在小菜蛾细胞中的表达

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的杆状病毒转移载体．ｐＡｃ３６０－β－ｇａｌ与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－ＰＸ２－ＨＮＵ２，Ｐｘ），利用Ｘ－ｇａｌ空斑检测分析，β－ｇａｌ基因成功地插入ＡｃＮＰＶ基因组中，得到重组病毒Ａｃ－β－ｇａｌ，重组病毒在Ｐｘ细胞中表达出受ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因启动子控制的具有生物活性的外源基因表达产物──β－ｇａｌ．

10亿PIB/mL苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂防治棉铃虫和小菜蛾田间药效试验

[目的]明确10亿PIB/mL苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂对棉花棉铃虫和甘蓝小菜蛾的田间防效。[方法]采用邓肯氏新复极差(DMRT)法对试验数据进行统计分析。[结果]10亿PIB/mL苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂对棉铃虫的防效药后3d分别为86.48%、88.68%、89.65%和93.64%,药后7d分别为89.40%、91.42%、91.96%和93.75%,保铃效果分别为87.08%、91.06%、91.93%和93.05%。对甘蓝小菜蛾的防效药后3d分别为58.48%、67.68%、74.65%和79.64%,药后7d分别为72.40%、79.12%、83.76%和87.75%,统计分析表明:在1500g/hm2(制剂量)处理后的3、7d,试验药剂对棉铃虫和小菜蛾的防效较优于对照药剂的防效。[结论]该药剂安全性好,对棉花及甘蓝生长无不良影响,推荐使用剂量为1125~1500g/hm2,使用方法为喷雾。