密码子优化前后AvBD2成熟肽基因的表达水平及其抑菌活性的比较

根据大肠杆菌的密码子偏好性,将编码AvBD2成熟肽的基因原片段Na-AvBD2优化为片段Op-AvBD2,将2条片段分别转化至大肠杆菌中重组表达,表达产物经GST树脂纯化后,对二者的表达水平和抗菌活性进行了比较。结果,融合蛋白rOp-AvBD2的表达量比rNa-AvBD2高2倍。而两者对大肠杆菌(CM-CC44102)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC533)和粪肠球菌(ATCC29212)的抑菌活性及对鸡白痢沙门氏菌(CVCC533)和粪肠球菌(ATCC29212)菌体超微结构的破坏程度无显著差异。结果提示AvBD2在预防和治疗细菌感染中具有替代抗生素的潜在应用价值,而密码子优化将成为通过基因工程生产AvBDs的可行途径。

黄麻羽肉鸡β-防御素基因AvBD 1和AvBD 2克隆、生物信息学分析及组织表达

【目的】防御素是生物体内产生的具有广谱抗微生物作用的活性肽。深入认识鸡β-防御素AvBD1和AvBD2的基本信息,有助于进一步研究和应用其生物学功能。【方法】采用PCR方法扩增黄麻羽肉鸡AvBD 1和AvBD 2基因并克隆测序,将测序获得的CDS序列推导成氨基酸序列后进行相似性比对,利用在线软件分析所预测蛋白的生物信息学特性,并探究二者在黄麻羽肉鸡不同组织中的表达情况。【结果】黄麻羽肉鸡AvBD 1和AvBD 2基因CDS区大小分别为198和195 bp,可编码65和64个氨基酸,二者CDS区序列相似度为56%,氨基酸序列相似度为36%,可见二者并非同源基因。系统进化树表明,黄麻羽肉鸡与其他几个品种鸡的亲缘关系较近,其中AvBD 1基因与小鼠亲缘关系最远;AvBD 2基因与大山雀亲缘关系最远。生物信息学分析结果显示,AvBD1和AvBD2均为疏水性蛋白,且AvBD1疏水性和稳定性均强于AvBD2,均存在信号肽,但所处氨基酸位点不同,无跨膜结构域,二级结构主要元件分别为α-螺旋和无规则卷曲,但参与形成这2种构象的氨基酸比例差异较大。实时荧光定量PCR分析发现,AvBD 1和AvBD 2基因在黄麻羽肉鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏和十二指肠组织中整体表达趋势相似,均以肺脏中表达量最高,十二指肠中表达量最低。【结论】试验成功克隆了黄麻羽肉鸡AvBD 1和AvBD 2基因CDS区全长序列,分析了AvBD1和AvBD2蛋白的结构和功能,二者在黄麻羽肉鸡内脏组织中的mRNA表达趋势一致,为进一步阐明AvBD1和AvBD2的生物学功能及其在生产中的应用提供参考依据。

鸭β-防御素2基因的克隆、表达和表达产物的生物学特性分析

【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素(AvBD)2基因,在大肠杆菌中高效表达,检测重组鸭AvBD2蛋白的生物学特性。【方法】应用RT-PCR技术从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-2的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。【结果】鸭胰腺组织中克隆出鸭AvBD2基因的cDNA大小为195bp,编码64个氨基酸。同源性分析表明,鸭AvBD2与其它物种AvBD2同源性较高。凝胶电泳结果显示重组鸭AvBD2蛋白在原核高效表达(分子量约为32kD),对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌与猪霍乱沙门氏菌的抗菌活性较弱。重组鸭AvBD2蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度为15.25～125μg·ml-1,对猪霍乱沙门氏菌最小抑菌浓度大于400μg·ml-1。重组鸭AvBD2蛋白在-20～100℃或pH3～12条件下处理30min后仍有抗金黄色葡萄球菌作用。【结论】克隆并表达了鸭AvBD2基因,表达产物具有抗菌活性,对温度和酸碱度有较高的稳定性。

重组鸡β-防御素2蛋白的表达与生物学活性鉴定

为探讨鸡β-防御素2(Av BD2)的生物学特性,研究将Av BD2基因克隆到原核表达载体p Pro EX HTa的Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒p Pro EX-Av BD2,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,用IPTG对其菌液进行诱导表达。Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明,His-Av BD2重组蛋白分子质量约12 ku,与预期一致。将该重组蛋白纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗肠炎沙门氏菌、四联球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等抑菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响及其溶血活性。结果显示,Av BD2重组蛋白对所测定的4株细菌有显著抗菌活性,高盐浓度显著降低其抗菌活性。该重组蛋白溶血活性极低。

稳定表达禽β防御素2的DF-1细胞系的建立及其抗大肠杆菌活性

旨在建立一株稳定表达禽β防御素2(AvBD2)的细胞系,并检测细胞系分泌产物对耐药菌株的抑制效果。首先,根据同源重组设计方法设计一组含有同源臂的AvBD2基因扩增引物及载体反向扩增引物,将片段连接至pLOV-eGFP真核表达载体,构建真核重组质粒pLOV-eGFP-AvBD2,利用三质粒表达系统将重组质粒与慢病毒包装质粒pSPAX2、外膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集细胞分泌上清液感染DF-1细胞,嘌呤霉素最适浓度筛选获得阳性克隆细胞系,通过RT-PCR技术和Western Blot方法对该细胞系构建结果加以验证;将细胞系分泌产物与耐药大肠杆菌菌株混合培养后,检测该蛋白抗菌效果,并通过扫描电镜观察菌体的损伤现象。结果表明,已成功构建一种稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系,其最适筛选浓度为含有1μg/mL的嘌呤霉素的细胞培养液。该细胞系传递20代后,在mRNA转录水平及蛋白表达水平均验证正确,将细胞系的分泌产物培养耐药大肠杆菌,细菌存活率曲线显示随着培养时间的增加,细胞系上清可明显抑制耐药菌株的增殖,在培养第5小时使供试菌的存活率低于50%。扫描电镜显示供试菌体表面皱缩,存在明显损伤,而对照组菌体光滑饱满。建立了稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供探索方向,同时也为后续评价和研究AvBD2的抗菌作用奠定基础。

鸡β-防御素2在大肠杆菌中的串联表达及抗菌活性分析

利用基因串联技术表达鸡β-防御素2(AvBD2)重组蛋白,分析其生物结构活性以及蛋白表达量变化。构建了重组串联表达载体p ET-28a-AvBD2op-AvBD2,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达融合蛋白,经镍柱纯化后进行Western-blot检测、Tricine-SDS-PAGE分析和MALDI-TOF-MS质谱分析。结果显示,单表达工程菌和串联表达工程菌均在9500 u处有特异性条带;采用BCA法测得的单、串联表达工程菌纯化后的蛋白质量浓度分别为0.258和0.769 mg/m L;通过凝胶成像系统分析,单表达工程菌中目标蛋白的表达量约占上清总蛋白的10.3%,而串联表达的约占上清总蛋白的18.3%;MALDI-TOF-MS质谱分析结果表明,单、串联表达蛋白产物的分子质量分别为4 300、7 811 u;琼脂孔穴扩散抑菌法检测证明纯化蛋白对多种微生物具有不同的抗菌活性。

鸡β防御素2在毕赤酵母中的组成型表达及其发酵条件的优化

合成鸡β防御素2(AvBD2)成熟肽基因,构建重组质粒pGHK-AvBD2;将其电转化至毕赤酵母GS115;Tricine-SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物,琼脂扩散法测定产物的抑菌活性,并测定产物的溶血活性;响应面法优化接种量、装液量和发酵温度。Tricine-SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,在5.8ku位置出现目的蛋白质条带;抑菌活性检测表明,表达产物对粪肠球菌(ATCC29212)、大肠杆菌(CMCC44102)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和巴氏杆菌具有明显的抑菌活性;发酵产物在500mg/L时的溶血活性仅2.17%。由建立的响应面模型得到重组酵母最佳发酵条件为:接种量528mg/100mL、装液量8.43%、发酵温度27.8℃,产物蛋白浓度较优化前提高20%。本研究实现了AvBD2在毕赤酵母中的组成型表达,表达产物有较好的抗菌活性,为AvBD2作为新型饲料添加剂的应用奠定了基础。