H5亚型禽流感病毒HA蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达与纯化

为表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白研制亚单位疫苗,构建了pFastBAC-HA重组质粒,转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组HA基因的杆状病毒质粒,再将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞,拯救重组病毒,通过间接免疫荧光和Western blot试验对Sf9细胞中表达的HA蛋白进行鉴定。结果表明表达的重组HA蛋白均能与抗Strep标签抗体、H5亚型禽流感病毒阳性血清(Re-11株)特异性结合,且HA重组蛋白在昆虫细胞中以细胞分泌上清的形式表达,红细胞凝集效价为1∶64,利用链霉素亲和层析的方法,纯化重组HA蛋白,纯化后HA蛋白浓度为0.364 mg/mL。试验结果可为禽流感病毒亚单位疫苗研制、HA蛋白单克隆抗体制备提供前期基础。

H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。

神经氨酸酶茎部氨基酸缺失对H5N1亚型禽流感病毒生物学特性的影响

近年来H5N1亚型禽流感病毒（AIV）神经氨酸酶（NA）茎部15—20个氨基酸的自发缺失时有报道，突变对于AIV生物学特性的影响还没有得到系统研究。应用反向遗传操作技术，拯救获得5株具有不同NA茎部长度的H5N1／PR8重组AIV。重组病毒的内部基因和血凝素（HA）基因来源相同，NA基因来源不同，并在NA茎部进行20个氨基酸的删除或添加突变。通过研究其生物学特性发现，5株重组病毒在SPF鸡胚中繁殖良好，其EID50、MDT和平均病毒滴度相似；NA茎部长短影响病毒的解凝能力，长茎病毒红细胞解脱能力比短茎病毒强；NA茎部15或20个氨基酸删除突变提高了重组病毒在MDCK细胞上的繁殖能力，短茎病毒释放出的病毒粒子数量是长茎病毒的10。100倍，释放时间提前6．10h，短茎病毒在MDCK细胞上形成的空斑也明显比长茎病毒的空斑大。实验结果揭示了AIVNA茎部氨基酸缺失突变的生物学意义，NA茎部15或20个氨基酸删除突变增强了AIV的细胞适应性，可能与现阶段H5N1亚型AIV宿主范围进一步扩大有关。利用反向遗传技术成功拯救了5株H5N1／PR8重组流感病毒，为流感病毒基因功能研究和重组疫苗研究建立了技术平台。通过对AIVNA茎部氨基酸的删除突变提高了病毒在MDCK细胞上的繁殖产量，为流感病毒细胞苗的生产提供了新的思路。

利用Rde/ET技术构建表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒

【目的】本研究以火鸡疱疹病毒(HVT)BAC分子克隆为平台,构建表达禽流感HA基因的重组火鸡疱疹病毒,以开发新型病毒活载体疫苗。【方法】利用Red/ET重组技术,经过两步法重组:第一步,用两端带有50bp大小左、右同源臂a和b的选择标记基因rpsL-neo表达盒替换HVT基因组US2区;第二步,用两端带有同样的50 bp左、右同源臂a和b的HA基因表达盒替换选择标记基因rpsL-neo表达盒。在含有氯霉素和链霉素双抗性的平板上筛选阳性克隆,经卡那霉素抗性反向筛选和PCR进一步鉴定,鉴定正确的克隆命名为pHVT-HA。提取并纯化pHVT-HA DNA,转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),以完成重组病毒的拯救。【结果】命名为pHVT-HA3的BAC克隆转染CEF后第4天,出现病毒噬斑,噬斑形态与野生型HVT相似,获得拯救的重组病毒,命名为rHVT-HA3,将重组病毒rHVT-HA3在CEF上连续传代培养,经PCR和间接免疫荧光检测表明,重组病毒在连续传代过程中仍能稳定表达HA蛋白。【结论】本研究以HVT BAC为平台,利用Red/ET重组技术,构建了表达禽流感A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的血凝素(HA)基因的重组火鸡疱疹病毒,为新型禽流感重组活载体疫苗开发奠定基础。

中国禽流感流行株的分离鉴定

分别从广东、四川、新疆等地禽流感（ＡＩ）血检阳性、发病率高、产蛋率下降的鸡群中采集１８６份病料，先后分离到６株Ａ型流感病毒。这些分离株可在鸡胚中传代，可凝集鸡红细胞，血凝价达１６０～１２８０倍。不被新城疫、减蛋综合症、败血支原体阳性血清所抑制。用这些分离毒株制成琼脂扩散（ＡＧＰ）抗原与禽流感标准阳性血清可出现白色沉淀线。分别将分离毒株与ＡＩ标准分型血清Ｈ１～Ｈ１４、Ｎ１～Ｎ９进行ＨＩ、ＮＩ试验，结果川和川农株均为Ｈ４Ｎ６，西昌１和２株及Ｓｈ株均为Ｈ９Ｎ２，新疆石河子（石）株为Ｈ１４Ｎ５。分离株分别做脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）、静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）测定，结果所有分离株ＩＣＰＩ介于０２４～１４８之间，ＩＶＰＩ介于０１５～０５６之间．通过电镜观察，可见直径为８０～１２０ｎｍ球状或杆状典型的禽流感病毒．经联机检索，从新疆石河子ＡＩ阳性鸡场产蛋下降的鸡群中分离出的Ｈ１４Ｎ５株为国内外首次从鸡中分离出的Ｈ１４亚型禽流感病毒。将某单位送检的禽流感鹅体分离株（Ｇ１株和Ｇ２株）做了血清型和毒力测定，试验结果认定，Ｇ１和Ｇ２株均为Ａ型禽流感病毒Ｈ５Ｎ１亚型，Ｇ１、Ｇ２株对鸡均达到高致病力毒株标准。

新型人感染H7N9型禽流感病毒研究进展

人感染新型H7N9型禽流感自2013年确诊以来全国蔓延,表现出极高的致病率及致死率,引发了极大的关注。该病由新型H7N9型禽流感病毒引起,该病毒基因突变率高,一旦发生对人类呼吸道上皮受体的适应性突变,极易导致暴发性大流行。文中从H7N9型禽流感的流行病学特征、病原学特征、感染患者的特征、检测措施及防治策略等方面对目前的研究进展进行综述。

2株鸭源H3N2亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

2008年10月到2009年9月从扬州活禽市场采集家鸭泄殖腔拭子共1075份,并从中分离鉴定了24株H3亚型禽流感病毒,作者对其中的2株病毒进行了全基因测序和遗传演化分析,发现2株病毒均为H3N2低致病性禽流感病毒。分离病毒各基因遗传进化分析均与猪源分离株的亲缘关系相对较近,与人源分离株的亲缘关系较远;除HA基因外,其它所有的基因均发生了不同程度基因重组,各基因与不同亚型、不同地区、不同宿主分离的不同毒株发生了基因重排。

两株H6N8亚型禽流感病毒分离株的分离与鉴定

为了解禽流感病毒(AIV)在我国华南地区的流行情况,我们对活禽市场中分离得到的两株鸭源H6N8亚型AIV[A/duck/Fujian/S2191/2011(H6N8)(FJ/191/11)和A/duck/Guizhou/S4035/2011(H6N8)(GZ/035/11)]进行全基因序列测定,并进行其对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验。序列分析显示:HA裂解位点基序为339PQIETR↓GLFG348,为低致病性AIV特征。内部基因分别源于两个国内流行的H6亚型病毒家系(ST339-like和HuN573-like)。序列分析表明FJ/191/11和GZ/035/11为H6亚型病毒与其他亚型AIV的N8NA基因发生重组,呈现明显的异源性。两分离株的感染性试验显示,它们对鸡和小鼠均呈低致病性;而且不能在鸡体内有效复制;对小鼠的感染性实验结果显示,小鼠肺脏和鼻甲病毒分离结果为阳性,其他脏器病毒滴定结果为阴性。

荧光定量RT-PCR方法检测感染小鼠不同组织中的H5N1禽流感病毒

目的测定H5N1禽流感病毒感染小鼠各脏器组织中的病毒核酸含量,了解病毒复制与疾病进程的关系,为H5N1禽流感病毒致病机理与防治研究提供技术支持。方法利用建立的荧光定量RT-PCR法对H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠的不同脏器组织中病毒核酸进行定量检测,观察H5N1禽流感病毒在不同组织中的复制情况。结果利用荧光定量RT-PCR法可从H5N1禽流感病毒感染小鼠后第3d的肺脏、脑、脾脏、肾脏和肝脏组织中检测到不同含量的病毒核酸;而在感染后4d的肺脏、脑和脾脏等组织中的病毒核酸含量开始下降;在感染后第6d,H5N1禽流感病毒核酸在肺脏和脑组织中大量存在外,其余组织中均有少量病毒核酸。结论H5N1流感病毒感染小鼠肺脏和脑组织中病毒核酸含量较高,说明病毒主要在小鼠的肺脏和脑组织中复制。由于荧光定量RT-PCR法可对感染小鼠不同脏器组织中的病毒核酸进行准确定量,可为H5N1禽流感病毒所致疾病的早期诊断、流行病学和致病机理研究提供技术支持。

2013-2017年浙江省绍兴市27例人感染H7N9禽流感病例流行特征分析

目的分析浙江省绍兴市2013-2017年人感染H7N9禽流感病例流行病学特征。方法收集2013-2017年绍兴市确诊的人感染H7N9禽流感病例临床特征和流行病学资料进行分析。结果 2013-2017年绍兴市共报告27例人感染H7N9禽流感确诊病例,88.89%的病例发生在冬春季,70.37%的病例患有慢性基础性疾病,74.07%的病例首发症状以发热为主。74.07%的病例有活禽市场暴露史,病例可疑暴露农贸市场外环境标本H7阳性率(16.45%)高于非农贸市场(3.51%),差异有统计学意义(χ~2=23.240,P<0.001)。结论绍兴地区人感染H7N9禽流感具有明显的季节性,男性、50岁以上人群、农民和基础性疾病患者是感染的高危人群。病例暴露于H7阳性率高的农贸市场可能是导致发病的主要原因。

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。

鹅禽流感免疫程序研究

为了科学制定鹅的禽流感疫苗免疫程序,进行了5方面的试验。结果表明,雏鹅首免后3周可测定出AI-HI抗体,4周达到高峰,AI-HI抗体为4.8log2,6周开始下降。产蛋鹅免疫后4周抗体达到高峰9～11 log2,直到8个月抗体水平仍然维持在7～9 log2。1日龄雏鹅母源抗体AI-HI价为9.3log2,28日龄降至4 log2以下。试验所用的3个厂家的疫苗首次免疫雏鹅的抗体水平上升无明显差异,二次免疫抗体水平上升有明显差异。二次免疫的免疫鹅体内抗体消长情况测定结果表明,以每只1.5mL的免疫效果最好,免疫持续期可达8个月。

H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的构建

为研制H9N2亚型禽流感病毒疫苗,本研究以具有良好抗原性的代表病毒株A/chicken/Hunan/S933/2008(H9N2)(HuN33)为HA和NA基因的供体,以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)的6个内部基因为骨架,利用反向遗传操作技术,救获了一株重组H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株Re-9。该疫苗候选株既具有很好的抗原性又具有较高的鸡胚增殖特性,从而为有效防控H9N2亚型禽流感的流行提供了技术储备。

基于PubMed数据库人禽流感研究的文献计量分析

从文献发表年限、文种、期刊、文献著者、国家地区分布、研究内容等方面进行了文献计量学研究,并对人禽流感研究文献的时间分布、文种分布、核心期刊分布、核心作者分布、国家和地区分布和文献类型分布等进行了探讨和对其发展动态和趋势进行了预测研究。

H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株HA1蛋白的原核表达

为表达H9N2亚型禽流感病毒的HA1蛋白,从H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株中扩增其HA1基因片段,将扩增得到的HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化到BL21(DE3)中进行表达。结果表明,IPTG诱导融合蛋白表达条件确定最佳诱导时间为8h,IPTG最佳终浓度为0.8mmol/L。经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,表达产物的分子质量约为61ku。

试验鸡感染H5N1亚型禽流感病毒后排毒规律的研究

目的 为揭示H5N1亚型禽流感病毒感染试验鸡后体内各组织的排毒规律。方法 将 180只 2 8d非免疫石岐杂鸡随机分为两组 ,每组 90只 ,一组为攻毒组 ,用含H5N1亚型AIV(A/Goose/GD/ 2 / 96 ,对 2 8d非免疫石岐杂鸡LD50 为 10 -5 4× 0 2ml)尿囊液 10 -4× 0 2ml/只经肌肉注射途径攻毒 ,一组接种 0 2ml/只灭菌生理盐水为对照。攻毒后前 4d ,每隔 6h观察试验组和对照组鸡的临床表现 ,每组随机抽取两只剖杀 ,收集脑、肝、脾、肾、胰腺、肌肉、喉头与泄殖腔拭子进行病毒分离 ;攻毒4d后改为每隔 12h取样 ,直至第 11d ,同时采集血清测定禽流感HI抗体效价。结果 试验鸡攻毒 18h后可从泄殖腔及喉头拭子中分离到病毒 ,持续到攻毒后第 7d左右 ;攻毒后 36h可以从脑、肝、脾、肾、胰腺的混合样品中分离到病毒 ,可持续到攻毒后第 10d左右 ;

病毒样颗粒为阳性对照的H5N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

合适的标准品对实时荧光定量PCR(qPCR)检测高致病性H5N1禽流感病毒(avain influenza virus,AIV)十分重要.本研究将H5N1AIV HA基因的部分序列插入到能够表达MS2噬菌体病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)DNA序列的表达载体上,诱导表达后得到了包裹有H5N1AIV HA基因RNA片段的VLP.该VLP能够耐受核酶的消化,形态与MS2噬菌体病毒颗粒形态相同.利用表达的VLP作为阳性标准品及设计的特异性荧光探针、淬灭链,使用优化的qPCR反应体系,得到qPCR检测H5N1亚型AIV的阳性对照标准曲线.研究结果为高致病性H5N1亚型AIV的准确定量检测提供了基础.

鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆和真核表达载体的构建

试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。

新城疫与禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活苗免疫效力试验

用新城疫病毒(NDV)LaSota株与禽流感病毒(AIV)F株尿囊腔接种非免疫鸡胚。取72～120小时死亡鸡胚液,灭活后分别制成新城疫油乳剂灭活苗、禽流感(H9亚型)油乳剂灭活苗、新城疫与禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活苗。免疫7日龄非免疫雏鸡,一周后开始检测ND、AI血凝抑制(HI)抗体,两周时各免疫组鸡的抗体效价都达到6log2以上,3周达到高峰,后维持在较高水平达45天以上。在65日龄进行攻毒,结果单苗和二联苗免疫鸡全部得到保护。

恒河猴二次接种H5N1亚型禽流感病毒

对恒河猴进行二次接种H5N1亚型禽流感病毒试验,并对二次接毒的结果进行观察,评估初次接毒对恒河猴二次接毒效果的影响。首次接种试验中,3、4、5号恒河猴用环甲膜穿刺注射方法接种含有H5N1亚型禽流感病毒的尿囊液,6号猴接种不含病毒的尿囊液。90d后,再次用环甲膜穿刺注射方法二次接种,4、5、6号猴接种7mlTCID50浓度为104.875病毒的尿囊液,3号猴接种7ml不含病毒的尿囊液。进行抗体等检测,并分别于72h无痛处死3、4、6号猴,第7d无痛处死5号猴,进行肺的病毒检测及病理观察。结果显示,3、4、5号猴至试验结束时体内依然有较高的抗H5N1亚型禽流感病毒抗体水平,6号猴没有抗体;通过RT-PCR以及免疫组化染色进行病毒检测,均只在6号猴肺部检出病毒,且6号猴肺部病理损伤最为严重。由此可以得出初步结论:在初次感染H5N1亚型禽流感病毒后90d,临床症状已基本恢复正常的恒河猴体内仍然有较高水平的抗体,此时,恒河猴抵抗H5N1亚型禽流感病毒二次感染的能力显著提高。