基于生物信息学方法设计鼠伤寒沙门氏菌OmpC-FliC多表位疫苗

为了设计鼠伤寒沙门氏菌OmpC-FliC多表位疫苗,试验在NCBI网站的Protein数据库中获取OmpC和FliC蛋白的氨基酸序列,采用Expasy服务器分析其理化性质,通过在线工具AllerTopV.2.0和Vexijen分析其抗原性和致敏性,应用NPS~@服务器分析二级结构,应用IEDB在线工具分析OmpC和FliC的B、T细胞表位。选取优势表位设计鼠伤寒沙门氏菌OmpC-FliC多表位疫苗,对其理化性质、抗原性、致敏性及三级结构进行预测。结果表明:OmpC和FliC均是亲水性蛋白,无致敏性,抗原性较高;OmpC和FliC蛋白均筛选出3个B细胞优势表位,2个细胞毒性T细胞(CTL细胞)优势表位,1个辅助T细胞(Th细胞)优势表位。设计的多表位疫苗为亲水性的稳定蛋白,抗原性预测的分数为1.1422分,且为非致敏原,预测三级结构模型的可信度大。说明鼠伤寒沙门氏菌OmpC-FliC多表位疫苗对动物无致敏性,且具有良好的抗原性。

马流产沙门氏菌研究进展

马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)是以引起母马流产、种马睾丸炎和小马驹败血症及多发性关节炎为主要症状的病原菌。近年来,由于马属动物集约化养殖,该病在我国山东、新疆、内蒙等马属动物养殖地区陆续发生,造成了严重的经济损失。论文通过对马流产沙门氏菌引起的临床症状、致病机制、疫苗研制等方面的研究进展进行论述或回顾,并对其研究趋势进行展望,旨在为更好地开展该菌引起的疾病的预防、控制和净化等提供参考。

重组减毒沙门氏菌疫苗候选株研究进展

疫苗是人和动物疾病防控的有效措施之一。减毒沙门氏菌不仅可以被用作疫苗,也被用作疫苗载体制备表达外源基因的重组疫苗。目前,重组减毒沙门氏菌疫苗主要通过重组载体(含宿主菌-载体平衡致死系统)或重组染色体来表达外源靶基因。重组靶基因的减毒沙门氏菌疫苗,进入动物或人体内后,不仅能够表达蛋白诱导相应的抗体,而且沙门氏菌也能促进细胞免疫应答,增强免疫效果。近些年,伴随着基因工程的发展,越来越多针对细菌、寄生虫和肿瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗候选株被构建,具有良好的免疫保护能力,展现出良好的应用前景。本文重点介绍重组减毒沙门氏菌疫苗研究和应用的最新进展。

基于重组减毒沙门氏菌载体递送疫苗及药物的肿瘤免疫治疗研究新进展

沙门氏菌介导的肿瘤免疫治疗方法已经成为抗肿瘤研究领域的热点之一。首先,沙门氏菌作为兼性厌氧菌,能够特异性地定植在肿瘤区域,直接杀伤肿瘤细胞或诱导机体产生免疫反应,介导包括巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞等在内的免疫细胞浸润从而发挥抗肿瘤效应。其次,沙门氏菌具有高度遗传修饰性,可被改造为毒力减低或精准靶向的重组沙门氏菌。此外,重组沙门氏菌还可作为疫苗、细胞毒性药物、RNAi和纳米颗粒递送的有效平台,在治疗的同时还可预防肿瘤的复发和转移。如重组沙门氏菌载体活疫苗裂解系统,能够加强肿瘤抗原呈递,促进T细胞发挥杀伤效应。本文介绍了减毒沙门氏菌载体的抗肿瘤免疫特性和肿瘤靶向性,并对以重组减毒沙门氏菌为递送系统进行肿瘤免疫治疗的研究进展进行综述。

减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的实验免疫效果研究

将运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗重组减毒鼠伤寒沙门氏菌以1.0×1010CFU剂量口服接种1日龄SPF雏鸡,结果表明重组菌对雏鸡具有良好的安全性。将重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)以2×109CFU的剂量两次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,同时,将重组菌分别与pVAX1-IFN-γ或pVAX1-IL2(200μg/只)联合免疫,通过测定小肠粘膜抗体效价,结果显示,重组菌单独免疫组和联合免疫组能激发机体产生粘膜免疫应答,且与空载体组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异(P<0.05)。攻毒后,免疫保护结果显示无论是重组菌单独免疫组还是联合免疫组均与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异(P<0.05),而重组菌单独免疫组与联合免疫组之间不存在显著性差异,说明重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)能够提供机体抵抗HPAIV H5亚型强毒攻击的良好的免疫保护作用,这为进一步筛选出基于粘膜免疫途径的新型禽流感基因工程疫苗奠定了基础。

携带新城疫病毒DNA疫苗的鼠伤寒沙门氏菌及其安全性与免疫效力

根据GenBank中发表的新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,获得重组真核表达质粒pVAX1F。将pVAX1F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1F)。重组菌以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡,结果表明,细菌对雏鸡具有良好的安全性,且不影响鸡的增重。将SL7207(pVAX1F)分别以108CFU和109CFU的剂量3次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,抗体检测结果显示,在三免后1周,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的血清抗体效价与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。重组菌两个剂量组在首免后2周开始出现粘膜抗体,并于二免后2周和3周达到较高水平。免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的保护率为77.27%,与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。

人乳头瘤病毒HPV16 E7蛋白基因在沙门氏菌疫苗菌株X4072中的表达

采用ＰＣＲ方法，从ＨＰＶ１６型质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｅ７基因片段，用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶解后，定向插入到表达质粒ｐＹＡ３３３２（ａｓｄ＋）的Ｐｔｒｃ启动子下游，构建成ｐＹＡ３３３２－ＨＰＶ１６－Ｅ７重组表达质粒。在大肠杆菌Ｘ６２１２上筛选出重组质粒后，通过中间菌株Ｘ３７３０的转化过渡，将重组质粒导入鼠伤寒沙门氏减毒疫苗菌株Ｘ４０７２（ａｓｄ－），构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的ＨＰＶ１６型重组疫苗。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ染色和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法分析证实。

稳定携带H5亚型禽流感病毒候选DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-HA扩增出禽流感病毒JSGO(H5N1)株的血凝素(HA)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1+中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-HA。通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207*,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207*(pmcDNA3.1-HA)。经体内体外试验证实,重组质粒pmcDNA3.1-HA在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-HA。将重组菌SL7207*(pmcDNA3.1-HA)和SL7207*(pcDNA3.1-HA)分别以2×109CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对禽流感病毒HA蛋白的黏膜抗体。重组菌以5×109CFU剂量两次口服免疫试验鸡,免疫鸡的小肠样品中可测到针对禽流感病毒HA蛋白的黏膜抗体,且SL7207*(pmcDNA3.1-HA)免疫组的抗体效价高于SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组。免疫保护试验结果显示,SL7207*(pmcDNA3.1-HA)和SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P<0.05),且SL7207*(pmcDNA3.1-HA)免疫组的保护率较SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组提高了22.6%,说明稳定携带H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性。

稳定携带新城疫病毒DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F中扩增出新城疫病毒JS5株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1+中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-F。通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pmcDNA3.1-F)。体内、体外试验结果表明,重组质粒pmcDNA3.1-F在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-F。将重组菌SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)分别以1×109CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和黏膜抗体。重组菌以5×109CFU剂量两次口服免疫4日龄SPF鸡,免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和小肠黏膜抗体效价水平与空载体组之间存在显著性差异(P<0.05)。免疫保护试验结果显示,SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P<0.05),且SL7207(pmcDNA3.1-F)免疫组的保护率较SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组提高了20.0%,说明稳定携带新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性。

携带新城疫病毒F基因DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建及其免疫原性

根据GenBank中发表的新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因序列,设计1对引物,通过RT-PCR扩增出鹅源NDV分离株JS5F基因(约1700bp),测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,获得重组真核表达质粒pVAX1-F。pVAX1-F经脂质体转染COS-7细胞,间接免疫荧光试验检测出F基因在COS-7细胞中的表达产物。将pVAX1-F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-F)。重组菌以109CFU/只的剂量2次免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对NDVF蛋白的血清抗体和小肠粘膜抗体应答,SL7207(pVAX1-F)免疫组抗体水平显著高于SL7207(pVAX1)组(P<0.05)。将SL7207(pVAX1-F)以109CFU/只剂量口服免疫1日龄雏鸡,免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1-F)免疫组对鸡具有良好的保护率(77.27%),与空白对照组和SL7207(pVAX1)空载体组之间存在显著性差异(P<0.05)。结果表明,该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能成功释放所携带的质粒,并能刺激机体产生免疫应答,可对NDV强毒攻击提供良好的免疫保护作用,提示该疫苗候选株对新城疫的控制有重要应用前景。

表达PRRSV GP3蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建

构建表达猪PRRSV GP3蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。将去信号肽序列的PRRSV ORF3基因插入到表达载体pYA3341(Asd+)中,构建重组质粒pYA3341-ORF3。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(Asd-、Cya-、Crp-),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF3)。体外鉴定重组菌表达的GP3蛋白、重组菌特性并进行小鼠免疫试验。酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳及Western blot检测有GP3特异性蛋白条带,小鼠免疫后可检测到GP3蛋白抗体。成功构建能稳定表达PRRSV GP3蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株。

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列 ,设计一对引物 ,通过RT PCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因 ,测序确认后 ,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asd pVAX1得到重组表达载体pVAX1 HA和asd pVAX1 HA。将重组质粒转染P815细胞 ,经间接免疫荧光试验证实 ,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4 5 5 0得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4 5 5 0 (pVAX1 HA)和X4 5 5 0 (asd pVAX1 HA) ,以 1× 10 9CFU 只的剂量两次口服免疫BALB c小鼠 ,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答 ,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击 ,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒 ,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。

表达鼠精子Cyritestin蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其鉴定

目的 构建表达鼠精子cyritestin蛋白的可口服减毒沙门氏菌活疫苗株。方法 应用质粒TAZ83/ 13,将之进行双酶切获得含有成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段。将其插入表达载体 pYA314 9中 ,构建重组质粒pCFL。将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4 6 32和X4 5 5 0中 ,以获得重组菌株X4 6 32 (pCFL)和X4 5 5 0 (pCFL)。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下 ,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。X4 5 5 0 (pCFL)在体内可较稳定地定居于Peyer’s结、肠系膜淋巴结和脾脏 ;X4 6 32(pCFL)可较稳定地定居于Peyer’s结。二者均可表达被抗cyritestin单抗 (mAb)识别的重组cyritestin蛋白。口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。结论 X4 6 32 (pCFL)、X4 5 5 0(pCFL)疫苗株的构建 。

携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析

【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株(SC-H)S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测S基因表达。通过电转化将pVAX-S转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建SL7207(pVAX-S)重组菌,并在体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,以RT-PCR、间接免疫荧光检测细胞内S基因的转录与表达情况。将SL7207(pVAX-S)重组菌以5×108、1×109、2×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性,并以1×109CFU剂量的重组菌3次免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG与肠道粘膜IgA抗体。【结果】成功构建重组质粒pVAX-S,且重组质粒能在COS7细胞中表达。重组菌SL7207(pVAX-S)感染巨噬细胞后检测到目的基因的转录、表达。小鼠口服接种不同剂量重组菌,具有良好的安全性。免疫小鼠于二免后两周可检测到针对TGEV S蛋白的特异性血清IgG与肠道粘膜IgA抗体,且三免后两周与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。【结论】携带TGEV DNA疫苗的减毒沙门氏菌小鼠试验显示了良好的免疫原性与安全性。

减毒鸡沙门氏菌97A疫苗株安全性和免疫效力试验

本试验将减毒鸡沙门氏菌 97A疫苗株分别以不同剂量经口服和肌肉注射接种 10日龄 AA肉鸡 ,结果表明 ,97A对10日龄雏鸡有良好安全性。将 97A分别以 10 8、5× 10 8、10 9个细菌的免疫剂量口服接种 10日龄 AA肉鸡 ,抗体检测结果显示 ,所有试验组鸡在第 7天均能检测到抗体 ,第 14天抗体水平均有不同程度的提高。于接种后 14天 ,用强毒鸡沙门氏菌 Sg9按口服或肌肉注射的方式攻击 ,免疫试验组均有很高的保护率 (≥ 80 % ) ,其中 5× 10 8个细菌免疫剂量保护率最高 (10 0 % ) ,而对照组鸡 10 0 %死亡。试验结果表明 ,97A是一株安全性好 ,免疫保护力高的口服疫苗用菌株。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建及动物免疫试验

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-ORF5。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5)。鉴定重组菌GP5蛋白的表达;测定重组菌定居特性及安全性;检测免疫小鼠血清抗体;流式细胞仪检测重组菌对小鼠T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响;最后进行免疫猪血清抗体检测。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;重组菌在体内可较稳定地定居于小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中,并在其中表达出GP5蛋白;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;重组菌口服免疫小鼠可以产生抗GP5蛋白抗体且抗体具有中和活性;重组菌株能不同程度地使CD4+、CD4+/CD8+升高,而使CD8+下降,表明重组菌对细胞免疫功能具有调节作用;淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱发小鼠产生较强的细胞免疫应答;重组菌口服免疫猪可以产生抗GP5蛋白抗体。本试验成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定基础。

鸡沙门氏菌外膜蛋白亚单位疫苗的研究Ⅰ.免疫激发复合物型(ISCOM)亚单位疫苗的研究

用十二烷酰肌氨酸法提取鸡沙门氏菌外膜蛋白（ＯＭＰ）.作为抗原，制备免疫激发复合物型（Immunostimulating Complex,ISOOM）亚单位疫苗。ISCOM型OMP亚单位疫苗在透射电镜下可见笼型颗粒结构，直径为６０ｎｍ～１２０ｎｍ。无菌性检测结果为无菌，具有可靠的安全性。对３周龄雏鸡肌注接种，６周龄攻毒，接种８０μｇＯＭＰ／只１ＳＣＯＭ型亚单位疫苗的雏鸡对鸡白痢沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌的攻击具有显著的免疫保护力。