副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究

[目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。[结果]重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和C型副鸡禽杆菌的保护率分别为0、20%和60%。[结论]本研究成功构建了原核表达载体pET-28a-lpxM,实现了lpxM重组蛋白的高效表达,且表现出良好的免疫原性。研究结果为探究副鸡禽杆菌外膜蛋白lpxM的免疫学特性以及为鸡传染性鼻炎的预防和疫苗的研发奠定了基础。

分光光度法与活菌计数法测定副鸡禽杆菌菌液浓度的相关性研究

为建立一种快速测定副鸡禽杆菌菌液浓度的方法,本研究选取副鸡禽杆菌血清A、B和C型代表性菌株(CVCC254株、CVCC257株和CVCC256株),培养制备菌液,分别在450、540、600、650 nm波长测定其吸光度值(OD值),同时测定活菌计数值。回归分析两组数据,获取回归方程及标准曲线,分析回归方程的测定系数(R^(2))和标准曲线的点线离散度,确定最适测定波长。再选取不同培养时间点(10、12、14、16、18、20 h)的菌液,在最适波长下测定其OD值并代入回归方程获取活菌数,同时采用活菌计数法获取活菌计数值,将两组数据使用SPSS 17.0软件进行统计分析,进一步验证分光光度法与活菌计数法测定菌液浓度的相关性。结果显示,3株菌液在600 nm波长测定的OD值与活菌计数值之间均呈最佳的线性关系,确定其菌液浓度最适测定波长均为600 nm,其回归方程分别为y=14.302x-0.1441(R^(2)=0.9962)、y=14.464x-0.2746(R^(2)=0.995)和y=14.681x-0.01326(R^(2)=0.9989),y为活菌计数值(×10^(8)CFU/mL),x为OD600值。3株培养至衰退期前的菌液在600 nm波长测定的OD值代入回归方程计算获得的活菌数值与其活菌计数值无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,衰退期前副鸡禽杆菌菌液的分光光度法与活菌计数法具有良好的相关性。因此,该分光光度法可用于快速测定衰退期前副鸡禽杆菌菌液浓度。

鹅源副鸡禽杆菌全基因组重测序及比较基因组学分析

为了分析鹅源副鸡禽杆菌(Apg)与鸡源菌株的基因组差异,对3株鹅源Apg和4株鸡源Apg进行全基因重测序及基因组分析。全基因重测序结果显示7株菌株基因组片段大小为2.567 832~2.607 127 Mb, GC含量介于40.80%~40.93%之间。SNPs同源性分析结果显示,3株鹅源菌株和鸡源C-AP3株聚集在p4chr1株的小分支上,另外3株鸡源菌株分布在其它国内菌株分支上。基因同源性分析结果显示鹅源菌株特有基因76个,鸡源菌株特有基因37个。对鹅适应性基因的筛查共聚类出79个基因,其中编码已知蛋白的基因有22个,其余编码假定蛋白;对鸡适应性基因的筛查聚类出39个基因,其中10个编码已知蛋白,29个编码假定基因。通过比较基因组学发现与Apg宿主适应性有关的基因为118个,为进一步阐释Apg跨物种感染的分子生物学机制奠定了基础。

江浙皖部分地区副鸡禽杆菌分离鉴定及生物学特性研究

为了解江浙皖地区鸡传染性鼻炎流行状况,对浙江、江苏和安徽部分地区疑似鸡传染性鼻炎的8个鸡场进行样品采集,对122份样品进行病原菌分离,对10株分离株进行形态学、卫星试验、PCR鉴定、生化鉴定和血清型鉴定等检测;利用分离株人工感染SPF鸡的动物回归试验,对攻毒后7 d和14 d的鸡只进行病理剖检和病理组织切片观察。结果表明,122份样品中副鸡禽杆菌阳性数为48个,阳性率为39.3%,8个养殖场的阳性率为36.8%~50.0%。10株副鸡禽杆菌分离菌,其中A型3株、B型4株、C型3株,致病率为60%~80%。表明不同血清型副鸡禽杆菌在江浙皖地区均有流行,具有一定的致病性,这为鸡传染性鼻炎三价疫苗研发和防控提供参考。

鹅源副鸡禽杆菌的分离鉴定及致病性研究

【目的】了解广东地区鹅源副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum,Apg)的生物学特性及其与国内外Apg菌株的差异。【方法】于2019年12月―2022年1月从广东地区采集疑似鹅传染性鼻炎病例,通过特异性PCR扩增、细菌分离纯化及16S rRNA基因测序鉴定后进行比对并构建系统进化树,确定分离菌株种类并对其进行药敏试验和动物回归试验。【结果】本试验共分离鉴定获得3株鹅源Apg,分别命名为G-AP1、G-AP2、G-AP3,均属于NAD依赖型菌株。分离菌株发酵葡萄糖、蔗糖产酸不产气,氧化酶试验阳性。系统进化树结果显示,3株分离菌株血清型均为A型且亲缘关系较近,与国内大部分分离株亲缘关系较近,与国外分离株亲缘关系较远。分离菌株接种试验鹅,24 h后鹅出现面部肿胀与流鼻液,48 h后挤压肿胀部位可见乳白色絮状的黏稠鼻液流出,剖检病鹅可见肿胀部皮下和鼻窦、鼻甲黏膜水肿、出血、纤维性渗出,鼻窦腔蓄积干酪样渗出物。药敏试验结果表明,头孢噻呋、头孢噻诺、阿米卡星、喹诺酮类药物、氟苯尼考和克林霉素对3株分离菌株具有较强的体外生长抑制作用。【结论】本试验成功分离3株鹅源Apg菌株,可引起鹅群感染发病且具有传染性,研究结果为广东地区防治鹅传染性鼻炎提供了参考依据。

C型副鸡禽杆菌山东株的分离及PCR鉴定

山东某免疫鸡传染性鼻炎(A型)灭活疫苗的蛋鸡场,在疫苗保护期内发生疑似鸡传染性鼻炎感染。通过对患病鸡进行剖检、细菌分离、PCR鉴定和血清型鉴定,结合HMTp210基因Region 2序列测序并分析,最终确定引起该蛋鸡场发病的病原是C型副鸡禽杆菌。

副鸡禽杆菌毒力质粒缺失株的构建及其致病性的研究

为研究副鸡禽杆菌(APG)质粒与菌株致病力的关系,本研究采用42℃诱导的方法缺失APG分离株APG-Hu中的毒力质粒,经PCR鉴定质粒缺失菌株后将其命名为APG-HuΔ。分别采用分光光度计测定OD600nm值法、微量生化鉴定管法、K-B纸片法和雏鸡感染试验测定APG-HuΔ的生长曲线、生化特性、药物敏感性和对雏鸡的致病性。结果显示,在42℃诱导条件下,能够有效缺失APG-Hu中的毒力质粒p250和p A14,而质粒p YMH5未被缺失;APG-HuΔ生化特性、生长曲线及耐药性与APG-Hu相比均无明显差异。雏鸡感染试验结果显示,多数APG-HuΔ感染鸡无明显临床症状,总体发病情况明显弱于同等剂量APG-Hu感染的鸡,表明APG-HuΔ毒力显著降低。本研究结果表明,APG毒力与质粒p250和p A14相关,而质粒p YMH5可能增加APG耐受多种抗生素的风险。本研究为APG致病机理及耐药机制研究奠定基础,也为挖掘APG质粒的应用潜力提供一定参考。

副鸡禽杆菌毒力因子研究进展

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum,Apg)是鸡传染性鼻炎的病原菌,可以引起鸡鼻腔分泌黏液性物质、打喷嚏、眶下窦肿胀、面部水肿和结膜炎等临床症状,导致病鸡生长不良,产蛋率急剧下降,从而危害养禽生产。Apg的致病性受多种因素影响,包括荚膜、脂多糖等细胞壁结构成分和菌体分泌的功能性蛋白(如血凝素和金属蛋白酶等)。本文从生物被膜及组分、细菌分泌物、铁离子获取和利用等方面对Apg毒力因子的研究进展进行归纳和综述,以期为鸡传染性鼻炎的科学防治提供理论参考。

鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗生产用菌株的筛选

为了筛选免疫原性良好的鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产用菌株,本试验对分离的5株A型、3株B型和3株C型副鸡禽杆菌的致病性和免疫原性进行分析。首先通过毒力试验筛选毒力较强的菌株,对筛选出的菌株进行最小发病剂量测定,再将最小发病剂量定为攻毒剂量,进行免疫原性分析和最小抗原含量测定。毒力试验结果显示,11株分离株均具有较强的毒力,从中筛选出毒力较强的A型菌2株(HN3株和HB2株)、B型菌2株(HN5株和SD4株)和C型菌2株(HN1株和SD3株)。最小发病剂量测定结果显示,A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株毒力最强,最小发病剂量分别约为2.0×10^(4)、1.8×10^(3)和2.3×10^(3)CFU。免疫原性分析和最小抗原含量测定结果显示,A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株具有良好的免疫原性,不仅可以抵抗同源菌株的攻击,还能对同血清型异源菌株提供良好的保护,免疫后血清HI抗体效价和阳性比例均较高,且与攻毒保护相关性较好,A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分别为5.0×10^(8)、1.0×10^(9)和1.5×10^(9)CFU/mL。因此,毒力较强和免疫原性良好的A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株副鸡禽杆菌可作为鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗的生产用菌株。

三型副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力试验

为探讨3株A型C-Hpg 8(CVCC254)、B型(BJ-05株)和C型(668)副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力,用120只57日龄SPF鸡进行了此3个菌株的致病力试验,分别眶下窦内接种1.5×104cfu/0.2 mL.只-1～400×104cfu/(0.2 mL/只-1)C-Hpg 8、BJ-05株和668株,每个剂量攻击5只鸡,攻毒后观察7 d,结果除1只鸡未发病外,119只鸡均呈现典型的鸡传染性鼻炎症状。结果表明,C-Hpg 8、BJ-05株和668株副鸡禽杆菌对SPF鸡均有很强的致病力。

B型副鸡禽杆菌安徽株的分离与鉴定

2012年12月,安徽某些蛋鸡养殖场出现大量鼻炎症状的病鸡,主要表现为眼结膜发炎,眼睑肿胀、流泪,一侧或两则颜面肿胀,产蛋鸡产蛋量明显下降。为探索该病病因及制定有效防治措施,对病鸡样品进行了细菌学检验。通过细菌分离、PCR、平板凝集及血清型检测等方法,鉴定出4株副鸡禽杆菌,该分离株感染试验鸡能复制出与临床表现一致的病例。经实验室检验确认,引起该病的病原体是B型副鸡禽杆菌。

副鸡禽杆菌抗原表位的筛选与鉴定

用C型副鸡禽杆菌(Apg)单克隆抗体作为靶标,筛选噬菌体展示随机12肽库,从中获得与之特异性结合的噬菌体克隆,建立了一种筛选副鸡禽杆菌表位的方法。测序结果显示,第3轮筛选后,80%的噬菌体克隆具有氨基酸共同序列Y-P-Q(A)WW,含有上述共有序列的噬菌体克隆不仅可以与靶抗体特异结合,还可与C型Apg细菌竞争结合靶抗体;将编码YSPHQWWLSGAV的DNA片段插入质粒pFliTrx的多克隆位点,转化E.coliGI826并在鞭毛成功展示;该重组菌能与靶抗体特异结合;用重组菌免疫试验鸡能产生C型Apg细菌的特异性抗体;用C型668株Apg攻毒,免疫接种鸡获得37.5%保护。提示该表位肽用于研制鸡传染性鼻炎疫苗具有广阔的应用前景。

副鸡禽杆菌3个血清型参考菌株生长曲线的测定和比较

为探索副鸡禽杆菌生长特性,比较不同血清型菌株生长特性的差异,采用分光光度法和菌落计数法分别测定副鸡禽杆菌血清A型(221株)、血清B型(0222株)、血清C型(Modesto株)3个参考菌株的生长曲线,对两种方法测定的生长曲线进行比较。结果表明,两种方法绘制的生长曲线差异较大,对数生长期和稳定期菌液OD 600nm值与活菌数对数之间呈现一元二次多项式回归关系。另外,3个血清型菌株的生长稳定期都比较短暂,各型菌株达到生长高峰的时间和活菌数都有差异。该试验为副鸡禽杆菌生物学特性的比较研究及疫苗的研制奠定了基础。

鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联灭活疫苗的研究

利用Page A型、B型、C型副鸡禽杆菌和新城疫病毒La Sota株,研制鸡传染性鼻炎（三价）和新城疫二联油乳剂灭活疫苗。用3个批次疫苗进行单剂量（0.5mL/次）3次接种和大剂量（2.0mL）单次接种的安全性试验、SPF鸡的免疫效力试验、商品鸡的免疫持续期试验和疫苗的保存期试验。结果表明,3批疫苗对试验鸡安全无副作用;免疫接种SPF鸡只30d后对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥80%,用20μL/只疫苗免疫接种SPF鸡21d后新城疫的平均HI抗体〉24;商品鸡42日龄首免,110日龄二免,二免后9个月对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%,对新城疫病毒强毒100%保护;用4℃-8℃保存12个月和15个月的3批疫苗进行了SPF鸡的近期免疫效力试验,结果对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%,用20μL/只疫苗免疫SPF鸡,免疫接种后21d新城疫病毒的平均HI抗体〉2^4,对新城疫病毒强毒的攻毒保护率〉70%。说明研制的疫苗安全有效。

B型副鸡禽杆菌田间分离株的毒力及免疫原性研究

为探索分离自安徽省某大型白羽鸡场的1株B型副鸡禽杆菌的毒力及免疫原性,本试验测定了该菌对5~6胚龄SPF鸡胚及35~40日龄SPF鸡的毒力,并用该菌株制备免疫原,免疫35~40日龄SPF鸡,用攻毒的方法测定菌株的免疫原性,同时对本菌株制备的抗原及目前国内、国外市场上销售的鸡传染性鼻炎A型、B型、C型三价或二价灭活疫苗的免疫效力进行比较。毒力试验结果显示,本菌株对SPF鸡胚的最小致死剂量为110 CFU,对SPF鸡的最小发病剂量为5.5×10^(3) CFU。免疫原性试验结果显示,本菌株制备的抗原免疫鸡能有效抵抗本菌株的攻击,说明本菌株的免疫原性良好,而市场上销售的鸡传染性鼻炎三价/二价灭活疫苗免疫鸡均无法抵抗本菌株的攻击,说明市场上销售的疫苗对本菌株的保护效果较差,B型菌疫苗间的交叉保护效果不理想。本试验为B型鸡传染性鼻炎疫苗的研究提供参考和物质基础。

副鸡禽杆菌外膜囊泡提取及成分分析

为研究副鸡禽杆菌外膜囊泡(OMVs)的构成,提取A型副鸡禽杆菌的OMVs,纯化并透射电镜观察其形态结构,检测其内毒素含量和DNA含量,分析其是否具有血凝活性,测定OMVs蛋白含量,并用质谱法分析了OMVs的蛋白组成成分。结果显示,副鸡禽杆菌的OMVs呈球形、泡状,直径为20 nm^300 nm,含有内毒素和少量核酸物质。该OMVs不能凝集鸡红细胞,Western blot结果表明,OMVs蛋白与该菌外膜蛋白单克隆抗体有阳性反应,构成OMVs的蛋白分子质量大多集中于65 ku和13 ku处,蛋白成分主要有ATP依赖性RNA解旋酶等多种功能酶、铁链霉素B受体、膜蛋白等结构成分和一些未知功能的假定蛋白等,为进一步分析副鸡禽杆菌外膜囊泡在致病和免疫方面的作用奠定基础。

副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum,Apg)是鸡传染性鼻炎的致病菌,可以引起急性呼吸道病,可导致蛋鸡产蛋率下降、从而造成严重的经济损失。副鸡禽杆菌引起的症状与鸡毒支原体等病原引起的其他上呼吸道传染病非常相似,本试验利用副鸡禽杆菌外膜蛋白,建立间接 ELISA 抗体检测方法,用于血清抗体的检测。通过分析副鸡禽杆菌外膜蛋白HMTp210中较为保守的P9片段,将其进行原核表达并纯化,纯化的P9蛋白免疫鸡制备了抗血清。结果显示,P9蛋白分子量62Ku,纯度80%以上。以纯化的蛋白P9作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原最佳包被浓度为1μg/Ml、血清样品最佳稀释度为1∶100,作用时间为 60min;酶标二抗的最佳稀释浓度为1∶10000,最佳作用时间为 30min;底物显色时间为15 min;阴、阳性的判定值为0.3。按上述条件建立的间接ELISA方法可以检测出P9蛋白免疫后的鸡血清及三种血清型副鸡禽杆菌的阳性鸡血清,与其他禽病病原体抗血清无交叉反应,本研究为检测副鸡禽杆菌血清抗体提供了一种新的方法。

副鸡禽杆菌LAMP检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了快速特异的检测副鸡禽杆菌的方法。利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0,针对副鸡禽杆菌16SRNA基因序列设计两组LAMP引物,并对副鸡禽杆菌特异性DNA的扩增条件进行优化,评价所建立LAMP的特异性和灵敏性。结果显示,优化后的反应条件为65℃恒温反应60min,内引物1.60pmol/μL、外引物0.20pmol/μL。该LAMP对13株副鸡禽杆菌均发生了扩增反应,而对大肠埃希菌、禽多杀性巴氏杆菌、空肠弯曲杆菌等14株其他病原微生物没有扩增反应;该LAMP最低检出量为0.17pg/反应,敏感性远高于常规PCR的56pg/反应。结果表明,所建立的副鸡禽杆菌LAMP具有快速、高效、方便操作等特点,适用于基层兽医部门进行副鸡禽杆菌的快速检测。

1例副鸡禽杆菌和鼻气管鸟杆菌混合感染的诊断

2019年3月,北京某鸡场产蛋鸡群中出现大量面部、眼睑严重肿胀等急性病例,为探明其发病原因,本试验进行了病原菌分离鉴定、分离株16S rRNA测序、药敏试验、动物回归试验。结果显示,从病鸡体内分离到副鸡禽杆菌和鼻气管鸟杆菌2种致病菌。血凝和血凝抑制试验结果表明,分离到的副鸡禽杆菌为A型;免疫琼扩试验结果显示,鼻气管鸟杆菌为A型。药敏试验显示,2株分离菌对氨苄西林、强力霉素等敏感,对链霉素及卡那霉素均不敏感。动物回归试验中,试验鸡单独感染副鸡禽杆菌分离株就会出现眼睑肿、浆液性鼻液、结膜炎等典型症状,单独感染鼻气管鸟杆菌的鸡也会发生流鼻液、呼吸紊乱等症状;混合感染的鸡发病症状比单独感染的鸡更为严重,病程加长。从人工感染发病鸡分泌物中可以成功分离出上述2种病原菌。本研究在国内首次发现副鸡禽杆菌和鼻气管鸟杆菌共感染的病例,为预防、控制和诊断鸡肿头综合征提供新思路。

副鸡禽杆菌荚膜多糖的提取及HPLC分析

为了研究副鸡禽杆菌的荚膜多糖的构成及生物学活性,本试验提取了B型副鸡禽杆菌的荚膜多糖,测定其含量,并分析单糖组分及分子量大小。用乙醇沉淀法在细菌培养液上清中提取了荚膜多糖,利用25%乙醇去核酸、苯酚抽提去蛋白,最后以苯酚-硫酸法测定其含量,高效液相色谱(HPLC)分析其组分及分子量大小。结果显示,每升菌液可以抽提得到荚膜多糖85mg,含量为59.6%,该多糖主要由L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖等单糖组成,总分子量约209Ku。